本发明专利技术公开了一种利用胚胎囊胚期细胞进行基因组扩增并结合高通量测序技术对植入前的胚胎进行染色体检测，从中筛选出染色体正常胚胎的方法，可以全面完整的分析胚胎基因组的遗传变异信息，从而指导植入前胚胎的选择，减少遗传性疾病，提高试管婴儿的成功率，所涉及的步骤包括：囊胚期滋养层细胞分离；全基因组扩增；DNA片段化；Proton文库构建、上机测序及测序数据分析。该发明专利技术利用发育到囊胚期的胚胎进行滋养层细胞分离检测，避免了卵裂期细胞分离对胚胎造成的伤害，获得细胞数量比卵裂期更多，提高了基因组扩增的成功率及扩增效果；囊胚期的胚胎经过自然淘汰过程，选择优质的囊胚期胚胎进行检测，更节约成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医学领域，具体地说，涉及一种利用体外发育到囊胚期的胚胎细 胞，在单细胞扩增基础上进行染色体异常检测的方法。
技术介绍
20年前，我国育龄人群中的不孕不育率仅为3%，处于全世界较低水平。2009中国 不孕不育高峰论坛公布的《中国不孕不育现状调研报告》显示，全国不孕不育患者人数已超 过5000万，以25岁至30岁人数最多，呈年轻化趋势，平均每8对育龄夫妇中就有1对面临 生育方面的困难，不孕不育率攀升到12. 5% -15%，接近发达国家15% -20%的比率。最为 严峻的是，这一比例还在不断攀升，卫生组织专家预估中国的不孕不育率将会在近几年攀 升到20%以上。 辅助生殖技术可有效解决这一问题，其中，试管婴儿是最受欢迎的一种辅助技术， 自1978年诞生第一位试管婴儿以来，目前全世界已有超过500万例试管婴儿诞生。近年来， 我国辅助生殖领域也处在高速发展阶段，但仍存在周期数高、妊娠率和活产率低的现状，造 成巨大的医疗资源的浪费和经济、健康损失，提高试管婴儿的成功率是各大辅助生殖中心 面临的主要问题。据报道，通过试管婴儿技术获得的胚胎通常有40% -60%存在染色体异 常，这是导致试管婴儿失败的主要原因之一，通过对植入前的胚胎进行遗传学检测，确保染 色体数目以及结构正常以后再进行胚胎植入，可以有效提高植入健康胚胎的概率，改善妊 娠结果，因此胚胎植入前遗传学筛查（PGS)技术开始越来越受到重视。 胚胎植入前遗传学筛查是指胚胎植入着床之前，对早期胚胎进行染色体数目和结 构异常的检测，通过一次性检测胚胎23对染色体的结构和数目，分析胚胎是否有遗传物质 异常的一种早期产前筛查方法。目前，临床上进行PGS检测的方法主要包括Fish、Array CGH等，然而这两种技术都存在一定的局限：FISH技术目前存在的问题在于无法一次性检 测所有染色体，操作繁琐，分辨率低；CGH的缺点在于只能检测已知的染色体异常，并且费 用昂贵。而利用半导体高通量测序法进行PGS检测，既弥补了FISH在准确度和检测通量方 面的缺陷，又降低了单个样本的检测成本，同时提高了检测准确度，已经成为未来PGS检测 的发展方向。 胚胎植入前染色体检测是通过分离胚胎中的部分细胞，通过对这部分细胞的检测 推断整个胚胎的染色体是否正常。无论基于何种检测技术，首先需要对体外发育中的胚胎 进行部分细胞的分离，目前常用的是卵裂球分离法，从发育到8细胞期的胚胎中分离出1-2 个卵裂球，通过对1-2个卵裂球进行单细胞扩增测序进行染色体异常检测，但由于模板数 量极少，经常容易发生扩增失败及扩增偏好性大的问题，影响实验结果。而囊胚期的胚胎相 对于卵裂期而言，细胞数量大量增加，而且此时形成的胚胎滋养层细胞不直接发育成胎儿， 可以分离5-10个滋养层细胞而胚胎的正常发育不会受到影响。本专利技术就是建立了一套分 离囊胚期胚胎滋养层细胞进行胚胎染色体检测的流程，该技术不仅仅提高了单细胞扩增的 成功率，结合高通量测序的方法也使染色体检测的准确度和灵敏度大幅提高，可达99%以 上。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种利用胚胎囊胚期细胞进行基因组扩增并 结合高通量测序技术对植入前的胚胎进行染色体检测，从中筛选出染色体正常胚胎的方 法，所涉及的步骤包括： 1、囊胚期滋养层细胞分离：在受精卵体外发育到第5天时，分离5-10个胚胎滋养 层细胞； 2、全基因组扩增：对分离出的细胞样本进行全基因组扩增，扩增后的样本用磁珠 法纯化DNA;对扩增的基因组DNA进行定量分析，分析检测结果显示无降解、无污染、符合二 代测序技术所要求的DNA起始量的样品才可以进行下一步实验；所述定量分析方法为琼脂 糖凝胶电泳、Agilent2100Bioanalyzer检测或QubitdsDNAHSAssayKit; 3、DNA片段化：对扩增样本进行酶切处理，使DNA的片段长度适合二代测序的长 度要求，用EDTA终止实验，然后用磁珠法纯化酶切产物；对于片段化后的DNA，使用Qubit dsDNAHSAssayKit进行定量分析，使用Agilent2100Bioanalyzer检测进行片段大小分 析； 4、Proton文库构建：用DNA酶切后的产物进行文库构建，DNA片段末端补平后纯 化，两端加特异性接头后纯化，PCR扩增后纯化； 5、上机测序：计算文库的稀释倍数，利用乳液PCR技术形成达到测序要求的阳性 测序模板，利用IonProton半导体测序系统对测序模板进行测序，最终获得每个DNA片段 的喊基序列； 6、测序数据分析：将测序结果利用生物信息学分析把这些序列定位到人类基因组 参考图谱上，通过与参考基因组的对比分析样本的染色体变异信息。 本专利技术的优点在于：利用发育到囊胚期的胚胎进行滋养层细胞分离检测，避免了 卵裂期细胞分离对胚胎造成的伤害，获得细胞数量比卵裂期更多，提高了基因组扩增的成 功率及扩增效果；囊胚期的胚胎经过自然淘汰过程，选择优质的囊胚期胚胎进行检测，更节 约成本；此外，本专利技术利用高通量测序的方法可以准确高效的对染色体全部的非整倍体异 常及4M以上的微缺失微重复等进行检测，检测通量高，准确性和灵敏度可达到99%以上。【附图说明】 为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使 用的附图作简单地介绍。 图1为用显微操作仪吸取胚胎滋养层细胞的操作图； 图2为基因组扩增后的Aglient2100分析结果图； 图3为本专利技术中3个样本的基因组扩增测序重复性分析图。【具体实施方式】 下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述。 实施例1 : 分离囊胚滋养外胚层细胞 选择试管婴儿中的高危人群（年龄多35,反复种植失败，反复流产）的体外受精胚 胎，采用常规胚胎活检方法获取囊胚滋养外胚层细胞；在胚胎发育到D3阶段时用激光进行 透明带打孔，继续培养至D5阶段，此时滋养外胚层细胞挤出透明带，如图1，用平口显微操 作针吸取部分滋养外胚层细胞（5-10个），用激光切断；吸取的细胞转移至PBS溶液中洗涤 3遍。 实施例2 : 裂解细胞及单细胞扩增 (1)细胞裂解 洗涤好的细胞转移至0. 2mL的PCR管，根据样本数量，混合细胞裂解缓冲液和细胞 裂解酶，将混合液加入到细胞样本中，单个样本反应体系如下表1所示： 表 1【主权项】1. ，其特征在于，包括如下 步骤： (1) 囊胚期滋养层细胞分离：从发育至囊胚期的受精卵中分离胚胎滋养层细胞； (2) 全基因组扩增：对分离出的胚胎滋养层细胞样本进行全基因组扩增并纯化、并进 行基因组DNA的定量分析； (3)DNA片段化：将步骤（2)中定量分析合格的基因组DNA进行片段化处理并定量分 析； (4)Proton文库构建后进行上机测序以获得每个DNA片段的碱基序列，并对碱基序列 进行分析以获得染色体变异信息。2. 根据权利要求1所述的， 其特征在于，步骤（1)中，在受精卵体外发育到第5天时，分离5-10个胚胎滋养层细胞。3. 根据权利要求1所述的， 其特征在于，步骤（2)中，对分离出的细胞样本进行全基因组扩增，扩增后的样本用磁珠法 纯化DNA;对扩增的基因组DNA进行定量分析，分析检测本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用囊胚期胚胎细胞进行胚胎染色体异常检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)囊胚期滋养层细胞分离：从发育至囊胚期的受精卵中分离胚胎滋养层细胞；(2)全基因组扩增：对分离出的胚胎滋养层细胞样本进行全基因组扩增并纯化、并进行基因组DNA的定量分析；(3)DNA片段化：将步骤(2)中定量分析合格的基因组DNA进行片段化处理并定量分析；(4)Proton文库构建后进行上机测序以获得每个DNA片段的碱基序列，并对碱基序列进行分析以获得染色体变异信息。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：梁波，孔令印，冒燕，宣黎明，申静静，祝轶君，
申请(专利权)人：苏州贝康医疗器械有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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