本发明专利技术涉及一种用于鉴定分枝杆菌菌种的试剂盒及方法，所述方法包括如下步骤：(1)引物和探针的设计合成；(2)、PCR反应组分，(3)、PCR扩增；(4)、熔解曲线分析。本发明专利技术利用荧光PCR和熔解曲线分析技术平台，创新性地应用带有核酸修饰的新型双标记和双特异性的探针检测临床常见12种分枝杆菌菌种，实现了各菌种间至少在一个检测通道中的Tm值之差大于等于4℃，可以准确有效的鉴定两种或多种菌同时存在的复合菌。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及，属于分子生物学技术领 域。
技术介绍
聚合酶链反应（PCR)技术自从1985年问世W来，经过几十年的发展，已成为实验 室的常规技术。它是现代分子生物学研究中不可缺少的手段，是一种极为敏感的放大系统。 相比于传统的临床诊断方法，核酸诊断是分子水平上的诊断技术，可W弥补传统临床诊断 方法的某些缺陷。因此，WPCR技术为代表的核酸诊断技术在临床诊断中得到日益广泛的 应用。[000引与传统的PCR检测模式相比，近年来将传统PCR检测模式中的PCR扩增和检测相 结合（即在同一个密闭容器中将PCR扩增反应与巧光标记探针检测结合在一起）检测目的 核酸的巧光PCR检验方法纷纷出台。巧光PCR检验方法不仅具有普通PCR的高灵敏性，而 且由于应用了巧光探针，所W还具有DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性，克服了 常规PCR的许多缺点，不需要PCR后处理，避免了常规PCR操作中的诸多弊端，从而可W快 速W及动态地检测PCR扩增产物并减少外来核酸造成的污染。 巧光PCR检测试剂最早使用的巧光染料包括：SYBRGREEN,EVEGREEN,染料方法尽 管简单，但无法识别非特异扩增，因此在实际应用中受到很大的限制。如今多W采用巧光探 针为基础方法，例如化qman探针、分子信标和巧光杂交探针等，巧光探针实时监控PCR扩增 产物的特异性，从而避免了非特异性扩增，提高了祀序列的特异性。不过如上所述的探针普 遍存在对单碱基突变或多碱基插入或缺失识别能力有限的缺点。 巧光PCR在临床上的应用主要分为：感染性疾病的诊断；遗传疾病的诊断；肿瘤的 诊断；母婴传播的诊断和法医学鉴定等。 临床可见能引起人类疾病的主要是结核分枝杆菌（MTB)，此外还有堪萨斯、鸟、 胞内、猿猴、赡餘、海、溃瘍、療痛、马尔摩、苏加、偶然、龟、脈肿等10余种非结核分枝杆菌 (NTM)。NTM病具有与结核病临床表现相似的全身中毒症状和局部损害，在无菌种鉴定结果 的情况下，与结核病难W鉴别。NTM与MTB药物敏感性大不相同，许多NTM对抗结核药物天 然耐药，不同NTM菌种对药物敏感性亦不相同，化疗方案应根据不同菌种有所不同，因此， 分枝杆菌菌种鉴定不仅在流行病学上，而且在临床诊断和治疗上均有重要意义。 而目前传统的分枝杆菌菌种鉴定方法依据生物学表型特征及细胞化学反应多项 指标综合分析，方法复杂、费时，急需建立快速、简便、准确的分枝杆菌菌种鉴定方法。近年 来，随着分子生物学理论及技术，特别是W聚合酶链反应（PCR)为基础的各种分子诊断技 术的快速发展，分子诊断技术已在分枝杆菌菌种鉴定中得W研究应用。 目前已有一些WPCR技术为基础的分枝杆菌菌种鉴定的方法，如PCR-直接测序 法、PCR-RFLP、PCR-基因忍片法等，运些方法普遍存在操作复杂，易造成交叉污染等缺点。 本专利技术人在2012年8月15日公开的名称为"一种新的分枝杆菌菌种快速鉴定方 法及试剂盒"的中国专利技术专利CN102634575B中公开了一种用于鉴定分枝杆菌菌种的试剂 盒，其中包括两对引物和Ξ条探针，所述两对引物包括引物TBleftl、TBleft2、TBri曲tl和 了8'1曲12，其核巧酸序列分别如沈9 10^:1、569 10^:2、569 10^:3、569 10^:4所 示，所述Ξ条探针TBProbel、TBProbe2、TBProbe3的5'端用报告巧光染料标记，3'端用泽 灭巧光染料标记，其核巧酸序列分别如SEQIDN0:13、SEQIDN0:14、SEQIDN0:15所示。 经过实验，专利技术人发现，此专利文献所公开的方法中由于只使用了普通双标记探针，部分菌 种间Tm值差异较小，仅适用于分离培养的单一菌种鉴定，而对两种或多种菌同时存在的情 况，则无法鉴别。 因此，提供一种能够准确有效的鉴定两种或多种分枝杆菌菌种的试剂盒和方法就 成为该
急需解决的技术难题。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种能够准确有效的鉴定两种或多种分枝杆菌菌种的 试剂盒。 本专利技术的上述专利技术目的是通过W下技术方案达到的： 一种用于鉴定分枝杆菌菌种的试剂盒，其中鉴别试剂包括Ξ对引物和五条探针， 所述引物包括上游引物primerl、下游引物primers、上游引物primers、下游引物primerA、 上游引物primer5和下游引物primerG;引物primer1、primer2、primer3、primerA、primer5 和primer6 的核巧酸序列分别如沈QIDNO. 6、SEQIDNO. 7、SEQIDNO. 8、SEQIDNO. 9、 SEQIDNO. 10、SEQIDNO. 11所示；所述探针包括3个区域：与所述祀核酸序列互补的5' 端单链祀核酸序列结合部位作为第1区域；与所述祀核酸序列互补的3'端单链祀核酸序列 结合部位作为第2区域；与所述5'端和所述3'端结合部位相连接的非结合突起部位作为 第3区域；所述五条探针分别为P;robel、P;robe2、P;robe3、P;robe4和ProbeS;其核巧酸序列 分别如沈QIDNO. 1、SEQIDNO. 2、SEQIDNO. 3、SEQIDNO. 4、SEQIDNO. 5 所示。 优选的，所述探针为带有核酸修饰的双标记和双特异性探针，核酸修饰为锁核酸 修饰，修饰所述探针第1区域内与祀核酸序列存在突变差异的核酸位点。 优选的，所述探针还包括一个巧光基团和一个非巧光巧灭基团，巧光基团标记在 所述探针的所述第1区域5'末端或所述第2区域3'末端，非巧光巧灭基团标记在探针的 第1区域内部的核巧酸残基上。 优选的，所述巧光基团选自肥X和/或R0X。 优选的，所述非巧光巧灭基团选自B册1和/或8册2。 优选的，所述的分枝杆菌选自结核分枝杆菌（M.化berculosis)、堪萨斯分枝杆 菌（M.kansasii)、療痛分枝杆菌（M.scrofulaceum)、海分枝杆菌（M.marmum)、溃瘍分枝 杆菌（M.ulcerans)、胞内分枝杆菌（M.intracellulare)、鸟分枝杆菌（M.avium)、耻垢分 枝杆菌（M.smegmatis)、偶然分枝杆菌（M.fortuitum)、龟分枝杆菌龟亚种（M.chelonae subsp.chelonae)、龟分枝杆菌脈肿亚种（Μ.chelonaesubsp.油scessus)、赡餘分枝杆菌 (Μ.xenopi)中的一种或二种W上的组合。 其中探针Probel可W有效鉴别结核分枝杆菌、海分枝杆菌/溃瘍分枝杆菌、胞内 分枝杆菌/鸟分枝杆菌/偶然分枝杆菌、療痛分枝杆菌/堪萨斯分枝杆菌、耻垢分枝杆菌/ 龟分枝杆菌/脈肿分枝杆菌/赡餘分枝杆菌；探针Probe2可W有效鉴别胞内分枝杆菌、鸟 分枝杆菌/赡餘分枝杆菌、偶然分枝杆菌/耻垢分枝杆菌、龟分枝杆菌/脈肿分枝杆菌；探 针Probe3可W有效鉴别海分枝杆菌、溃瘍分枝杆菌；探针Probe4可有效鉴别龟分枝杆菌、 脈肿分枝杆菌；探针Probes可有效鉴别療痛分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌。 本专利技术的另一目的是提供一种上述试剂盒在制备用于鉴定分枝杆菌的产品中的 应用。 本专利技术的上述专利技术目的是通过W下技术方案达到的： 上述用于鉴定分枝杆菌菌种的试本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于鉴定分枝杆菌菌种的试剂盒，其中鉴别试剂包括三对引物和五条探针，所述引物包括上游引物primer1、下游引物primer2、上游引物primer3、下游引物primer4、上游引物primer5和下游引物primer6；引物primer1、primer2、primer3、primer4、primer5和primer6的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示；所述探针包括3个区域：与所述靶核酸序列互补的5’端单链靶核酸序列结合部位作为第1区域；与所述靶核酸序列互补的3’端单链靶核酸序列结合部位作为第2区域；与所述5’端和所述3’端结合部位相连接的非结合突起部位作为第3区域；所述五条探针分别为Probe1、Probe2、Probe3、Probe4和Probe5；其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴雪琼，张俊仙，汪君，黄利维，孙伟民，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三〇九医院，无锡锐奇基因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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