一种特异性检测肽聚糖的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种特异性检测肽聚糖的试剂盒，包括酚氧化酶原，显色液，肽聚糖标准品，为避免葡聚糖等其他干扰因子的影响，本发明专利技术试剂盒还包括碱金属氢氧化物处理剂或生物缓冲液处理剂以及由碱金属氢氧化物和生物缓冲液组成的中和液处理剂。为长久保存反应结果，本试剂盒还包括酸性终止液。本发明专利技术试剂盒可特异性的检测人体无菌体液内的肽聚糖，免受葡聚糖等干扰因子的干扰；灵敏度和特异性都较高，与血培养菌株鉴定结果符合率高，可满足临床检测需要；可以使用实验室普通酶标仪进行检测，降低了检测成本；终止体系反应后，可以较长时间的保存实验结果，并可以反复利用酶标仪对实验结果进行重复测量；操作简单，不需要长时间的经验积累，易于推广。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及试剂盒，尤其是涉及一种特异性检测肽聚糖的试剂盒。
技术介绍
由细菌感染而导致的菌血症及败血症等严重威胁着人类生命健康。近年来，因细菌感染引起的感染性疾病的发病率随着抗生素滥用、免疫抑制及免疫耐受人群的快速扩大而急剧上升，主要原因包括以下几个方面：一是导致机体抵抗力严重低下的各种危重疾患不断增多，包括恶性肿瘤和恶性血液病、艾滋病、糖尿病、自身免疫病、严重烧伤和创伤、长期吸毒等，以及人口老龄化趋势的加快，这些疾病的患者无疑是细菌感染的高危人群；另一方面，科学的进步、医学的发展在提高疗效增进健康的同时也造成了不可避免的负面影响，如医源性免疫受损，包括广谱抗生素、皮质类固醇激素和免疫抑制剂的广泛使用，腹膜透析、化疗放疗和导管插管等新技术的推广普及，这些都成为细菌感染的危险因素。肽聚糖为细菌所特有，是细菌细胞壁的主要组成成分，广泛存在于革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）的细胞壁中，其中革兰氏阳性细菌胞壁所含的肽聚糖占干重的50-80%，革兰氏阴性细菌胞壁所含的肽聚糖占干重的5-20%。真菌、病毒、动植物细胞和人体细胞及其他病原体均无此成分。细菌入侵人体后，被人体白细胞吞噬，在溶酶体等的消化作用下细菌的细胞壁被破坏，细胞壁中的肽聚糖被释放到血液中，引起血液中肽聚糖含量的升高，因此，人血中肽聚糖的检测是诊断人体无菌体液细菌感染，特别是革兰氏阳性菌感染的一个重要的指标。目前肽聚糖检测方法主要是血淋巴法和速率微孔板法。日本和光纯药的SLP试剂和Immunetics公司的BacTx?BacterialDetectionKit等产品，就是采用的血淋巴法。但是和光纯药的SLP试剂不能区分肽聚糖和葡聚糖，而肽聚糖和葡聚糖分别指示的是细菌感染和真菌感染，治疗药物完全不同，且该种方法还不能用于人体检测；Immunetics公司的BacTx?BacterialDetectionKit已通过美国FDA认证，但是也不能区分肽聚糖和葡聚糖，且仅能检测人体血液制品（血小板）。速率微孔板法是根据样本加入后显色速率的变化判断样品中肽聚糖的有无及多少，其缺点是：（1）、必须使用带温浴、震板功能同时进行动力学读数的酶标仪。（2）、检测过程中需要较长时间占用酶标仪。（3）、实验体系反应结束后，反应体系不能较长时间保存，不能重复测量检测结果。（4）、不能采用肉眼对于显色结果进行判读。除此之外，肽聚糖的检测方法还有双抗体夹心的酶联免疫法，这种方法目前仅见用于某些动物样本的肽聚糖含量检测，由于抗肽聚糖单抗可能仅仅用某种细菌细胞壁的肽聚糖成份免疫所得，因此能否检测所有细菌至少检测多数细菌的肽聚糖尚值得怀疑，也就是说此产品的灵敏度尚待考证和提高。相比血培养、病理组织学方法等耗时长、敏感性低、容易受到干扰等不足，肽聚糖检测需要具有简便、快速、准确、特异、灵敏度高等优点的其他检测方法有望作为传统检测方法的补充，为临床快速早期诊断人体无菌体液细菌感染提供全新的技术手段。但目前该市场还在开发中，市场上现有的产品还存在一些严重缺陷，要么是肽聚糖与葡聚糖混合检测，不能特异性检测肽聚糖，要么是方法学的灵敏度尚待考证和提高，因此临床实验室迫切需要灵敏度和特异性能够满足对细菌感染诊断需求的肽聚糖检测试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的就在于针对现有技术存在的缺陷，提供一种不受葡聚糖等因素干扰，操作简单，易于推广的特异性检测肽聚糖的试剂盒。为实现上述目的，本专利技术可采取下述技术方案：本专利技术所述的特异性检测肽聚糖的试剂盒，包括酚氧化酶原，显色液，肽聚糖标准品，为避免葡聚糖等其他干扰因子的影响，本专利技术试剂盒还包括碱金属氢氧化物处理剂或生物缓冲液处理剂以及由碱金属氢氧化物和生物缓冲液组成的中和液处理剂。为长久保存反应结果，本试剂盒还包括1%~10%的酸性终止液，其酸性终止液可为HCl、H2SO4、草酸、甲酸、乙酸、丁二酸、苯甲酸或柠檬酸等。本专利技术试剂盒所用的碱金属氧化物处理剂为0.01%~15%的KOH或NaOH等；所用的生物缓冲液处理剂为0.05%~10%的TAPS、EPPS、ACES、BES、Bicine、CHES、HEPES、HEPPSO、MES、MOPS、MOPSO、CAPS、TAPSO、TES或Tricine。本专利技术所用的酚氧化酶原分离自昆虫血淋巴，昆虫血淋巴可以分离自家蚕(BombyxmoriLinnaeus)、烟草天蛾(Manducasexta)、大蜡螟(Galleriamellonella)、金星叶槭大蚕蛾(HyalophoracecropiaLinnaeus)、黑腹果蝇(DrosophilamelanogasterMeigen)、冈比亚按蚊(AnophelesgambiaeGiles)、东北大黑鳃金龟(HolotrichiadiomphaliaBates)、蜚蠊(Blaberusdiscoidalis)、亚洲飞蝗(Locustamigratoriamigratoria)、蛄(Pacifastacusleniusculus)等。本专利技术反应体系中采用的显色液包括多巴(又称二羟苯丙氨酸、左旋多巴)、多巴胺、3,4-二羟基苯乙酸(DhyAcA)、3,4-Dihydrohyphenyl丙酸(DhyPrA)、儿茶酚、MBTH、DOPA或上述物品的组合物溶液。利用可溶性或不可溶性肽聚糖标准品配制时，所用稀释液为无热原水、缓冲液或动物源血浆等。本专利技术的优点在于可以特异性的检测人体无菌体液内的肽聚糖，免受葡聚糖等干扰因子的干扰；灵敏度和特异性都比较高，与血培养菌株鉴定结果符合率高，可以满足临床检测需要；可以使用实验室普通酶标仪进行检测，降低了因购买带温浴、震板功能同时进行动力学读数的酶标仪而产生的成本；终止体系反应后，可以较长时间的保存实验结果，并可以反复利用酶标仪对实验结果进行重复测量；操作简单，不需要长时间的经验积累，易于推广。本专利技术的反应原理为：由于肽聚糖是细菌细胞壁的主要组成成分，它是由N-乙酰葡萄糖胺（NAG）和N-乙酰胞壁酸（NAMA）交替连接的杂多糖与不同组成的肽交叉连接形成的大分子。酚氧化酶原激活系统是昆虫等非特异性免疫系统的重要组成部分，微量的异物入侵或外界物理伤害都会引起酚氧化酶原激活系统的激活，该系统在激活过程中会产生一系列具有生理活性的物质，这些活性物质可通过多种方式参与宿主防御反应，最终实现黑化、硬化、伤口愈合及免疫保护的作用。该酚氧化酶原激活系统可被细菌细胞壁中的肽聚糖或真菌细胞壁中的β-1-3-葡聚糖激活，产生酚氧化酶，酚氧化酶作用于相应的显色底物显色，终本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种特异性检测肽聚糖的试剂盒，包括酚氧化酶原，显色液，肽聚糖标准品，其特征在于：还包括碱金属氢氧化物处理剂或生物缓冲液处理剂以及由碱金属氢氧化物和生物缓冲液组成的中和液处理剂。

【技术特征摘要】
1.一种特异性检测肽聚糖的试剂盒，包括酚氧化酶原，显色液，肽聚糖标准品，其特征
在于：还包括碱金属氢氧化物处理剂或生物缓冲液处理剂以及由碱金属氢氧化物和生物缓
冲液组成的中和液处理剂。
2.根据权利要求1所述的特异性检测肽聚糖的试剂盒，其特征在于：还包括1%~10%的酸
性终止液。
3.根据权利要求1所述的特异性检测肽聚糖的试剂盒，其特征在于：所述碱金属氧化物
处理剂为0.01%~15%的KOH或NaOH；所述生物缓冲液处理剂为0.05%~10%的TAPS、EPPS、ACES、
BES、Bicine、CHES、HEPES、HEPPSO、MES、MOPS、MOPSO、CAPS、TAPSO、TES或Tricine。
4.根据权利要求1所述的特异性检测肽聚糖的试...

【专利技术属性】
技术研发人员：王则宇，杨红云，张硕，孙武举，李彬，李晓霞，刘志磊，付光宇，吴学炜，
申请(专利权)人：郑州安图生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41