一种用于分步培养hUC-MSC的试剂盒及采用所述试剂盒获得的hUC-MSC制造技术

本发明专利技术公开了一种人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSC)无血清培养方案。该方案采用分步法培养hUC-MSC：先使用TME培养基培养3-4小时促进hUC-MSC贴壁，然后更换为TMD培养基进行快速扩增。TME和TMD无血清分步培养法很好地解决了hUC-MSC无血清培养方法中细胞贴壁能力差、增殖缓慢、易分化等问题，为hUC-MSC进行长期稳定的无血清培养技术奠定基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及干细胞的研究领域，特别是涉及一种hUC-MSC的新型、高效的无血清分步培养试剂盒。
技术介绍
间充质干细胞普遍存在于人体多种组织和器官中，并具有多向分化潜能，具有刺激组织再生、调节免疫等功能，在细胞治疗领域有着广阔的应用前景。骨髓间充质干细胞已经在临床上得到了广泛应用，而目前的研究表明，脐带来源的间充质干细胞不但能够成为骨髓间充质干细胞的理想替代物，而且具有更大的应用潜能。其中，源于人脐带的人脐带间充质干细胞(humanUmbilicalCordmesenchymalstemcells，hUC-MSC)表达多种胚胎干细胞的特有标志，具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低、取材方便、无道德伦理问题的限制、易于工业化制备等特征，而且研究证实hUC-MSC在神经疾病、免疫系统、内分泌系统以及癌症、心脏病等疾病的动物模型和临床研究中有良好治疗效果，因此有可能成为最具临床应用前景的多能干细胞。若要将hUC-MSC进一步应用于临床，最重要的就是hUC-MSC的体外大量扩增达到有效的临床治疗剂量，因此hUC-MSC的体外培养成为了最基础同时也是最重要的技术之一。现有的hUC-MSC培养方法多采用在基础培养基中添加FBS、青链霉素，但非人血清成分复杂，使hUC-MSC在长期的培养过程中易分化，且非存在传播异种病原体的危险。此外，虽然已有科研工作者开发出多种类型的血清替代物，但目前市<br>场可购买的供hUC-MSC培养的血清替代物以及完全培养基的培养效果仍不理想，尤其对于干细胞的贴壁、增殖、以及细胞长期培养后的稳定性的维持等特性均无法达到预期效果。
技术实现思路
因此本专利技术的目的是针对本领域的需要，提供一种用于培养hUC-MSC的培养基，从而获得贴壁能力好、增殖快速、易分化的hUC-MSC。本专利技术的另一目的是提供通过本专利技术的培养基获得的hUC-MSC。具体而言，本专利技术提供一种新型的无血清分步培养hUC-MSC的试剂盒培养方案，该试剂盒至少包括不同组成的两种培养基，利用该试剂盒中的培养基可在无血清环境下进行hUC-MSC的分步培养和长期扩增培养，同时确保其在长期培养情况下依然保持多潜能性及较强的增殖能力。本专利技术的技术方案如下。一方面，本专利技术提供了一种用于分步培养hUC-MSC的试剂盒，所述试剂盒包括分开放置的TME培养基和TMD培养基。该两种培养基均无血清成分，且用于分步培养hUC-MSC。其中，所述hUC-MSC为从自然分娩或剖宫产的健康新生儿脐带组织分离出的人脐带间充质干细胞。目前本领域已有多种公知的人脐带间充质干细胞分离方法。本专利技术提供的试剂盒中，所述TME培养基包含a-MEM、β-巯基乙醇和非必需氨基酸。优选地，所述TME培养基含有0.05-0.2体积份的β-巯基乙醇、0.5-2体积份的非必需氨基酸水溶液和95-100体积份的a-MEM，其中，所述非必需氨基酸水溶液包含浓度各为8-12mM的甘氨酸、丙氨酸、L-天门酰胺、L-天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸；更优选地，所述TME培养基含有0.1体积份的β-巯基乙醇、1体积份的非必需氨基酸水溶液和99体积份的a-MEM；进一步优选地，所述TME培养基由所述a-MEM、β-巯基乙醇和非必需氨基酸水溶液组成。本专利技术提供的试剂盒中，所述TMD培养基含有a-MEM/DMEM-F12、β-巯基乙醇、非必需氨基酸、重组人碱性成纤维生长因子(b-FGF)和血清替代物。优选地，所述TMD培养基包含0.05-0.2体积份的β-巯基乙醇、0.5-2体积份的非必需氨基酸水溶液、8-12体积份的血清替代物、85-95体积份的a-MEM/DMEM-F12和终浓度为5-15ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子，其中，所述非必需氨基酸水溶液包含浓度各为8-12mM的甘氨酸、丙氨酸、L-天门酰胺、L-天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸；更优选地，所述TMD培养基包含0.1体积份的β-巯基乙醇、1体积份的非必需氨基酸水溶液、10体积份的血清替代物、89体积份的a-MEM/DMEM-F12和终浓度为10ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子。优选地，所述TMD培养基由所述a-MEM/DMEM-F12、β-巯基乙醇、非必需氨基酸水溶液、重组人碱性成纤维生长因子和血清替代物组成。根据本申请的具体实施方式，所述非必需氨基酸水溶液可以采用Gibco公司货号为11140的产品。根据本申请的具体实施方式，所述血清替代物可以采用KnockOutTMSerumReplacement(Gibco公司产品，货号10828-010)。使用本专利技术的试剂盒可以分步培养hUC-MSC，培养方法包括：先使用所述试剂盒中的TME培养基培养hUC-MSC，然后使用所述试剂盒中的TMD培养基进行培养。即先后采用两种培养基进行培养；进一步地，所述培养方法包括以下步骤：(1)将hUC-MSC以0.5-4×104个细胞/cm2的密度接种于所述试剂盒中的TME培养基中培养3-6小时；(2)弃去TME培养基，PBS清洗，更换为所述试剂盒中的TMD培养基，每3-5天更换新鲜的TMD培养基；(3)待细胞达70-90％汇合后，收集细胞备用、冻存或重复步骤(1)和(2)传代培养；可选择地，取步骤(3)收集的hUC-MSC细胞，检测以下项目中的一项或多项：分化能力、细胞活性、细胞纯度、细胞污染和增殖特性。优选地，所述培养方法包括以下步骤：(1)将hUC-MSC以2×104个细胞/cm2的密度接种于所述试剂盒中的TME培养基中培养3-4小时；(2)弃去TME培养基，PBS清洗1次，更换为预先37℃孵育的所述试剂盒中的TMD培养基，每3天更换新鲜的TMD培养基；(3)待细胞达90％汇合后，收集细胞备用、冻存或重复步骤(1)和(2)传代培养；可选择地，取步骤(3)收集的hUC-MSC细胞，检测以下项目中的全部：分化能力、细胞活性、细胞纯度、细胞污染和增殖特性。根据本专利技术的具体实施方式，所述用于hUC-MSC的无血清分步培养方法包括以下步骤：(1)使用TME培养基以一定密度接种hUC-MSC于六孔板或T75培养瓶内进行贴壁培养；优选地，hUC-MSC的接种密度为约2×104个细胞/cm2；(2)接种4小时后，用移液器小心吸弃旧TME培养基，用PBS洗一遍，更换为同样预先37℃孵育的TMD培本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于分步培养hUC‑MSC的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括分开放置的TME培养基和TMD培养基，其中所述TME培养基含有a‑MEM、β‑巯基乙醇和非必需氨基酸，所述TMD培养基含有a‑MEM/DMEM‑F12、β‑巯基乙醇、非必需氨基酸、重组人碱性成纤维生长因子(b‑FGF)和血清替代物。

【技术特征摘要】
1.一种用于分步培养hUC-MSC的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒
包括分开放置的TME培养基和TMD培养基，其中所述TME培养基含有
a-MEM、β-巯基乙醇和非必需氨基酸，所述TMD培养基含有
a-MEM/DMEM-F12、β-巯基乙醇、非必需氨基酸、重组人碱性成纤维生长
因子(b-FGF)和血清替代物。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述hUC-MSC为从
自然分娩或剖宫产的健康新生儿脐带组织分离出的人脐带间充质干细胞。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述TME培养
基含有0.05-0.2体积份的β-巯基乙醇、0.5-2体积份的非必需氨基酸水溶液
和95-100体积份的a-MEM，其中，所述非必需氨基酸水溶液包含浓度各
为8-12mM的甘氨酸、丙氨酸、L-天门酰胺、L-天冬氨酸、谷氨酸、脯氨
酸和丝氨酸；
优选地，所述TME培养基含有0.1体积份的β-巯基乙醇、1体积份的
非必需氨基酸水溶液和99体积份的a-MEM；
优选地，所述TME培养基由所述a-MEM、β-巯基乙醇和非必需氨基
酸水溶液组成。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述
TMD培养基包含0.05-0.2体积份的β-巯基乙醇、0.5-2体积份的非必需氨
基酸水溶液、8-12体积份的血清替代物、85-95体积份的
a-MEM/DMEM-F12和终浓度为5-15ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子，
其中，所述非必需氨基酸水溶液包含浓度各为8-12mM的甘氨酸、丙氨酸、
L-天门酰胺、L-天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸；
优选地，所述TMD培养基包含0.1体积份的β-巯基乙醇、1体积份的
非必需氨基酸水溶液、10体积份的血清替代物、89体积份的
a-MEM/DMEM-F12和终浓度为10ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子；
优选地，所述TMD培养基由所述a-MEM/DMEM-F12、β-巯基乙醇、

\t非必需氨基酸水溶液、重组人碱性成纤维生长因子和血清替代物组成。
5.使用权利要求1至4中任一项所述的试剂盒分步培养hUC-MSC的
方法，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭镭，
申请(专利权)人：郭镭，里程，圣释北京生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11