本发明专利技术公开了一种用于扩增产氢微藻莱茵衣藻插入突变基因侧翼序列的引物及方法。本发明专利技术提供了序列表的序列1、序列2所示DNA、兼并引物和序列表的序列8所示DNA组成的引物组合物；所述兼并引物为针对莱茵衣藻的基因组DNA的兼并引物。应用本发明专利技术提供的引物组合物可以获得莱茵衣藻突变体的基因组DNA中巴龙霉素编码基因的插入位点。本发明专利技术提供的方法，将设计的两条特异性引物与TAIL-PCR所用的简并引物进行组合，在优化的PCR反应条件下，可高效特异的扩增插入突变基因侧翼序列。本发明专利技术对高通量克隆莱茵衣藻基因、研究基因功能具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种。
技术介绍
莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是50多年来用于研究光合作用机理的模式生物。2007年全基因组序列信息的获得，为从基因组水平研究莱茵衣藻各种生命活动特征及分子调控机理提供了可以利用的高通量分子操作平台。在全基因组序列信息的基础上，如何确定各个基因的功能，研究基因与表型的关系是当前的主要问题。与其它的模式光合生物相比，莱茵衣藻基因组序列具有GC含量高、 重复序列多等特点，采用传统的基因克隆方法不容易成功。所以研究单个基因与表型的关系具有一定难度。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于扩增莱茵衣藻插入突变基因侧翼序列的引物及方法。本专利技术提供了序列表的序列I所不DNA(SpO)、序列表的序列2所不DNA(Spl)、兼并引物和序列表的序列8所示DNA (ACl)组成的引物组合物；所述兼并引物为针对莱茵衣藻的基因组DNA的兼并引物。所述兼并引物具体可为序列表的序列7所示DNA (LAD-5-RMD227)、序列表的序列3 所示DNA(LADl)、序列表的序列4所示DNA(LAD2)、序列表的序列5所示DNA(LAD3)或序列表的序列6所示DNA(LAD4)。本专利技术还保护一种获得莱茵衣藻突变体的基因组DNA中巴龙霉素编码基因的插入位点的方法，包括如下步骤(I)提取莱茵衣藻突变体的基因组DNA ；(2)以基因组DNA为模板，用序列表的序列I所示DNA和所述兼并引物作为引物进行第一轮PCR扩增，得到第一轮PCR扩增产物；(3)以第一轮PCR扩增产物为模板，用序列表的序列2所示DNA和序列表的序列8 所示DNA作为引物进行第二轮PCR扩增，得到第二轮PCR扩增产物；(4)将第二轮PCR扩增产物进行测序，通过与野生型莱茵衣藻的基因组序列进行比对，得到莱茵衣藻突变体的基因组DNA中巴龙霉素编码基因的插入位点；所述莱茵衣藻突变体是在莱茵衣藻中导入PSI103质粒得到的突变体。所述第一轮PCR扩增的反应条件具体如下(1)93°C2 分钟;(2) 95 °C I 分钟;(3) 940C 30 #, 680C I 分钟，72°C 3 分钟，11 个循环；(4) 940C 30秒，25 0C 2分钟，以0. 5度/秒的速度升温至72 °C，72°C 3分钟；(5) 94°C 20 #,68°C I 分钟，72°C 3 分钟，26 个循环；(6) 72 °C 5 分钟。所述第二轮PCR扩增的反应条件具体如下(1)94。。20 #, 670C I 分钟，72°C 3 分钟，2 个循环；(2) 94 0C 20 秒，68 V I 分钟，72 V 3 分钟，94 V 20 秒，68 V I 分钟，72 V 3 分钟， 940C 20秒，500C I分钟，720C 3分钟，14个循环；(3) 72 °C 5 分钟。巴龙霉素的蛋白序列具体可如序列表的序列15所不，其编码基因具体可如序列表的序列16所示。野生型莱茵衣藻的基因组序列可以从NCBI (美国生物信息学中心)获取，也可以从衣藻基因网站(http: / / genome. igi_Dsf.org/cgi_bin/runAlignment db = Chlre4&advanced = I)中获取。所述引物组合物可用于获得莱茵衣藻突变体的基因组DNA中巴龙霉素编码基因的插入位点。所述引物组合物或所述方法可用于辅助鉴定莱茵衣藻的基因组DNA中各基因功倉泛。本专利技术还保护一种辅助鉴定莱茵衣藻的基因组DNA中各基因功能的试剂盒，包括 PSI103质粒和所述引物组合物。所述莱茵衣藻具体可为莱茵衣藻藻种CC400 (mt-)。本专利技术提供的方法，将设计的两条特异性引物与TAIL-PCR所用的兼并引物(简并引物)进行组合，在优化的PCR反应条件下，可高效特异的扩增插入莱茵衣藻基因组DNA的外源基因的侧翼序列。因此，可以将外源DNA随机插入莱茵衣藻的基因组DNA，得到各种突变株，再采用本专利技术的引物和方法确定外源基因的插入位点，通过比较突变株和野生株的表型差异辅助确定发生插入突变所在的基因的功能。采用本专利技术的引物和方法的主要优点有(1)高通量；如果采用96孔PCR仪，一次可完成数十个目的片段的扩增；(2)引物特异性强；采用本专利技术的引物进行PCR扩增，第二轮反应后就可以检测到特异的条带，与传统方法相比特异性明显提高；(3)操作简便快速；只需在普通PCR仪上设定反应程序，在当天(一般约8小时内)就可完成一次扩增反应。本专利技术对高通量克隆莱茵衣藻基因、研究基因功能具有重要意义。附图说明图I为TAIL-PCR扩增产物的电泳图；1-1 :以第一个突变体的基因组DNA为模板，用SpO和LAD-I进行第一轮扩增，用 Spl和ACl进行第二轮扩增的PCR扩增产物；1-2 :以第一个突变体的基因组DNA为模板，用 SpO和LAD-2进行第一轮扩增，用Spl和ACl进行第二轮扩增的PCR扩增产物；1_3 以第一个突变体的基因组DNA为模板，用SpO和LAD-3进行第一轮扩增，用Spl和ACl进行第二轮扩增的PCR扩增产物；1-4 :以第一个突变体的基因组DNA为模板，用SpO和LAD-4进行第一轮扩增，用Spl和ACl进行第二轮扩增的PCR扩增产物；1-5 :以第一个突变体的基因组DNA 为模板，用SpO和LAD-5-RMD227进行第一轮扩增，用Spl和ACl进行第二轮扩增的PCR扩增产物；2-1 :以第二个突变体的基因组DNA为模板，用SpO和LAD-I进行第一轮扩增，用 Spl和ACl进行第二轮扩增的PCR扩增产物'2-2 以第二个突变体的基因组DNA为模板，用 SpO和LAD-2进行第一轮扩增，用Spl和ACl进行第二轮扩增的PCR扩增产物；2_3 以第二个突变体的基因组DNA为模板，用SpO和LAD-3进行第一轮扩增，用Spl和ACl进行第二轮扩增的PCR扩增产物；2-4 :以第二个突变体的基因组DNA为模板，用SpO和LAD-4进行第一轮扩增，用Spl和ACl进行第二轮扩增的PCR扩增产物；2-5 :以第二个突变体的基因组DNA 为模板，用SpO和LAD-5-RMD227进行第一轮扩增，用Spl和ACl进行第二轮扩增的PCR扩增产物；3-1 以第三个突变体的基因组DNA为模板，用SpO和LAD-I进行第一轮扩增，用 Spl和ACl进行第二轮扩增的PCR扩增产物；3-2 以第三个突变体的基因组DNA为模板，用 SpO和LAD-2进行第一轮扩增，用Spl和ACl进行第二轮扩增的PCR扩增产物；3_3 以第三个突变体的基因组DNA为模板，用SpO和LAD-3进行第一轮扩增，用Spl和ACl进行第二轮扩增的PCR扩增产物；3-4 :以第三个突变体的基因组DNA为模板，用SpO和LAD-4进行第一轮扩增，用Spl和ACl进行第二轮扩增的PCR扩增产物；3-5 :以第三个突变体的基因组DNA 为模板，用SpO和LAD-5-RMD227进行第一轮扩增，用Spl和ACl进行第二轮扩增的PCR扩增产物；CC400-1 以莱茵衣藻藻种CC400 (mt-)的基因组DNA为模板，用SpO和LAD-I进行第一轮扩增，用Spl和ACl进行第二轮扩增的PCR扩增产物本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄芳，赵磊，杨浩萌，陈梅，
申请(专利权)人：中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。