本发明专利技术涉及一种检测Tgf2转座子在金鱼基因组插入侧翼序列和拷贝数的方法：通过对带有Tgf2转座子的金鱼基因组DNA提取；再对全基因组DNA进行限制性内切酶酶切；酶切好的DNA片段与splinkerette接头连接；接下来分别进行第一轮PCR和第二轮PCR分别扩增转座子插入位点5'和3'侧翼序列，对第二轮PCR产物进行克隆和序列测定，从而检测出Tgf2转座子在鱼类基因组侧翼序列，并推测插入的拷贝数。本发明专利技术优点在于：具有简便、高效和低成本特点，可为利用Tgf2转座子介导的其他鱼类基因组插入诱变和转基因后代的拷贝数和侧翼序列的检测提供快速、准确的方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及鱼类基因工程领域，具体地说，是，及其在金鱼Tgf2转座子插入位点检测中的应用，适用于在金鱼和养殖鱼类Tgf2转座子介导的转基因或插入诱变后代中进行快速准确的开展基因组插入拷贝数和侧翼序列的鉴定。
技术介绍
DNA转座子(transposon)是一类能在宿主基因组中变更插入位置的可移动遗传因子，其变更插入位置的过程称为转座(transposition)。很多不同的转座子(如P因子和Mosl)介导的基因组插入诱变已被作为大规模遗传筛选的工具，不仅在单细胞生物如细菌和酵母中，而且在多细胞生物包括蠕虫、果蝇和拟南芥的研究中都被证明是成功的，它们为发现和解码这些生物的性状主控基因作出了巨大的贡献。近年来，我们在一些金鱼品系中发现了一个新的、具有天然转座活性MT家族转座子，为近年发现的第二例具有天然转座活性的脊椎动物转座子，根据国际转座子的命名标准，命名该转座子为Tgf2转座子。Tgf2转座子来源于鲤科鱼类，其在鲤科养殖鱼类中的转基因整合率约为50%，是第I代线性化质粒注射方法的10倍。与昆虫PiggyBac转座子倾向插入TTAA和Tcl/mariner转座子家族偏好AT位点相比，鲤科Tgf2转座子为随机插入，这为开辟鲤科养殖鱼类全基因组插入诱变研究奠定了物质基础。目前，进行转座子在生物基因组插入拷贝数和侧翼序列一般采用反向PCR(inverse PCR)方法。反向PCR在扩增前先用限制性内切酶酶切样品基因组DNA，再用DNA连接酶连接成一个环状DNA分子，然后通过反向PCR扩增引物的上游片段和下游片段，并进行测序，从而获得插入拷贝数的侧翼序列和拷贝数。反向PCR方法存在一些缺点和不足，例如，I、酶切、自连过程受到很多不确定因素的影响，需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段，这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA ;2、为提高分子间连接的效率，连接反应中基因组DNA的浓度要低，因为高浓度的DNA可能会提高非同源连接水平，从而产生非特异扩增；3、成环的双链DNA分子易于形成超螺旋而不利于PCR反应，它只可以扩增出较短的DNA片段；4、鱼类转座子插入位点存在多拷贝，反向PCR引物可能与多个基因序列杂交，严重干扰转座子插入位点侧翼序列的鉴定。中国专利文献CN101962659A公开了一种基于Tgf2转座子的鱼类基因转移载体及其制备方法，由转基因供体质粒和辅助质粒组成，转基因供体质粒由鱼类启动子序列，如斑马鱼KrtS启动子、目的基因、以及金鱼Tgf2转座子左右臂序列构建，辅助质粒由斑马鱼β -actin启动子和金鱼Tgf2转座酶编码基因构建，为进行鱼类转基因研究提供了新方法。中国专利文献CN101962660A公开了一种基于Tgf2转座子的鱼类转基因方法及其载体和载体的制备方法，通过注射转基因供体质粒，并辅以基于Tgf2转座酶mRNA两种载体，共同注射入鱼类1-2期细胞期受精卵，即可实现高效转基因，与常规鱼类转基因技术相比，具有整合效率高、负载容量大、通用、安全和高效的优点。但是关于目前还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案是，所述的方法包括以下步骤(I)通过对带有Tgf2转座子的金鱼基因组DNA提取；(2)再对全基因组DNA进行限制性内切酶酶切；(3)酶切好的DNA片段与splinkerette接头连接；(4)接下来分别进行第一轮PCR和第二轮PCR分别扩增转座子插入位点5’和3’侧翼序列，对第二轮PCR产物进行克隆和序列测定，从而检测出Tgf2转座子在鱼类基因组侧翼序列，并推测插入的拷贝数，所述的检测出的Tgf2转座子在鱼类基因组侧翼序列数即为插入的拷贝数。 所述的步骤(I)中的金鱼基因组DNA带有Tgf2转座子插入位点，包括基因组本身带有Tgf2转座子的金鱼各品系，以及通过转座方式插入Tgf2转座子的其他鱼类。所述的步骤(2)中的限制性内切酶为Sau3Al，酶切好的DNA片段带有"GATC"粘性末端。所述的步骤(3)中的splinkerette接头包含长序列SEQ ID No: I和短序列SEQID No:2。所述的splinkerette接头的合成步骤为把权利要求4所述的splinkerette接头长序列与短序列等浓度等体积混合，95°C保温5min，然后以1°C /15s逐步降至4°C，长序列与短序列退火形成splinkerette接头。所述的splinkerette接头一侧带有段序列的"GATC"粘性末端，另一侧带有由于短序列中的AT碱基互补配对形成一个7bp的发卡结构而形成错配区。所述的步骤(3)中酶切好的DNA片段与splinkerette接头均带有〃GATC〃粘性末端，通过T4连接酶连接,形成酶切DNA片段两端带有splinkerette接头的DNA片段。所述的步骤(4)中进行转座子插入位点5’侧翼序列扩增的第一轮PCR，所用引物为 Splinkl :SEQ ID %:5和18€2-5’65卩3: SEQ ID No: 3 ;对第一轮PCR产物稀释50倍，并进行第二轮 PCR，所用的引物为Splink2: SEQ ID No:6 和 Tgf2_5’GSP4 :SEQ ID No:4，对第二轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，割胶回收后与T载体连接，克隆到大肠杆菌DH5 α中，挑选阳性克隆进行序列双向测定，检测出Tgf2转座子在金鱼基因组5’侧翼序列，并推测出插入拷贝数。所述的步骤(4)中进行转座子插入位点3’侧翼序列扩增的第一轮PCR，所用引物为Splinkl: SEQ ID No: 5和 Tgf 2-3’GSPl: SEQ ID No: 7 ;对第一轮 PCR 产物稀释 50 倍，进行第二轮PCR，所用的引物为Splink2: SEQ ID吣:6和了8€2-3’65卩2: SEQ ID No:8，对第二轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，割胶回收后与T载体连接，克隆到大肠杆菌DH5 α中，挑选阳性克隆进行序列双向测定，检测出Tgf2转座子在金鱼基因组3’侧翼序列，并推测出插入拷贝数。本专利技术优点在于1、可在金鱼基因组Tgf2转座子插入后代中，进行快速准确的开展基因组插入拷贝数和侧翼序列的鉴定； 2、本专利技术与现有技术相比，具有简便、高效和低成本特点，可为利用Tgf2转座子介导的其他鱼类基因组插入诱变和转基因后代的拷贝数和侧翼序列的检测提供快速、准确的方法。附图说明附图I是金鱼基因组提取琼脂糖凝胶电泳图谱。附图2是合成的带有"GATC"粘性末端和一个7-bp发卡结构的splinkerette接头图谱。附图3是金鱼基因组DNA用限制性内切酶Sau3Al酶切后的琼脂糖凝胶电泳图谱。附图4是Splinkerette PCR法扩增Tgf2转座子5’侧翼序列的琼脂糖凝胶电泳图谱。附图5是Tgf2转座子在金鱼基因组插入区5’端的序列比对结果。附图6是Splinkerette PCR法扩增Tgf2转座子3’侧翼序列的琼脂糖凝胶电泳图谱。附图7是Tgf2转座子在金鱼基因组插入区3’端的序列比对结果。附图8是Tgf2转座子插入金鱼基因组的琼脂糖凝胶电泳图谱。附图9是Tgf2转座子插入金本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邹曙明，田玉梅，蒋霞云，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。