一种扩增水稻T-DNA插入位点侧翼序列的方法技术

本发明专利技术公开了一种扩增水稻Ｔ－ＤＮＡ插入位点侧翼序列的方法。本发明专利技术所提供的扩增水稻Ｔ－ＤＮＡ插入位点侧翼序列的方法，包括以下步骤：１）酶切连接：在同一反应体系中，利用平端限制性内切酶酶切水稻基因组ＤＮＡ并利用Ｔ↓［４］ＤＮＡ连接酶将得到的酶切片段与不对称接头序列连接，得到酶切连接液；所述不对称接头序列为由一条长链和一条短链组成的双链接头，长链和短链互补，并且在水稻基因组中无同源序列，长链具有至少两个嵌套引物的结合位点；２）以步骤１中的酶切连接片段为模板，以根据所述不对称接头序列和Ｔ－ＤＮＡ的左边界序列设计的嵌套引物进行两轮嵌套引物ＰＣＲ扩增，得到Ｔ－ＤＮＡ插入位点侧翼序列。本发明专利技术适用于高通量水稻基因组分析。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种扩增水稻T-DNA插入位点侧翼序列的方法。
技术介绍
水稻是世界上一半以上人口的主要食物，是有代表性的谷类作物。因其相对较小的基因组，成熟的转化技术体系，构建的很好的物理图谱，大量的cDNA序列以及indica和japonica两个亚种接近完成的基因组测序计划，水稻已成为单子叶植物基因组学研究的模式系统。一般用来研究基因功能的途径是创建DNA插入突变体群体，再利用对突变体筛选和表型鉴定来鉴别基因。T-DNA插入突变体库是水稻功能基因组学研究的重要平台之一，T-DNA插入位点侧翼序列的分离有利于T-DNA插入方式和水稻重要农艺性状基因的功能分析。水稻T-DNA插入位点侧翼序列的扩增方法有质粒挽救法，cDNA末端快速扩增法(分为5-端RACE和3-端RACE法)，反向PCR法(iPCR)，热不对称PCR法(TAIL-PCR)等。传统的方法如反向PCR法，其扩增效率受限于插入位点的序列和基因组DNA的酶切位点数目，而且其所扩增得到的序列片段大小不够大，有时不能从基因数据库获得足够的同源序列信息。质粒挽救法受菌种培养的限制而且时间漫长。TAIL-PCR必须在不同温度下进行多步PCR。这些方法操作步骤繁琐，侧翼序列扩增效率底，费时费力，不适合于高通量序列扩增分析。目前，模式植物拟南芥可用PCR-walking方法来分析T-DNA插入片段旁侧的植物基因组DNA信息。如图1所示，其主要步骤如下首先用平端限制性内切酶对植物基因组DNA进行酶切消化，然后将接头退火复性到切割出来的平端片段上。一个步测的引物(WP)是根据T-DNA的左边界序列(LB)的3’侧设计的，另一个引物是根据接头的序列设计(AP)的。用WP和AP就可以扩增出T-DNA插入片段侧翼的植物DNA序列或有可能插入进去的载体骨架序列。一般设计2-3套嵌套的WP和AP引物，进行2-3轮的巢式PCR，就可以得到可以进行进一步研究所需量的PCR产物。但目前，没有一套适合于水稻的PCR-walking技术体系。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种快速特异扩增水稻T-DNA插入位点侧翼序列的方法。本专利技术所提供的扩增水稻T-DNA插入位点侧翼序列的方法，包括以下步骤 1)酶切连接在同一反应体系中，利用平端限制性内切酶酶切水稻基因组DNA并利用T4DNA连接酶将得到的酶切片段与不对称接头序列连接，得到酶切连接液；所述不对称接头序列为由一条长链和一条短链组成的双链接头，长链和短链互补，应有较高的GC含量，并且在水稻基因组中无同源序列，长链具有至少两个嵌套引物的结合位点；2)以步骤1中的酶切连接片段为模板，以根据所述不对称接头序列和T-DNA的左边界序列设计的嵌套引物进行两轮嵌套引物PCR扩增，得到T-DNA插入位点侧翼序列。为了提高扩增的特异性，所述不对称接头序列的短链的3′端修饰有NH2基。为了确保充分酶切，步骤1)中的酶切连接反应体系可为10μl，所述酶切连接反应体系的组成及反应条件为水稻基因组DNA 40-100ng，平端限制性内切酶3U，T4DNA连接酶70U，1×T4DNA连接酶缓冲液，不对称接头序列50μM，加双蒸水到l0μl，25℃反应6-16个小时。其中，所用试剂均购自大连宝生物工程有限公司。所述反应体系的组成及反应条件优选为水稻基因组DNA 82.5ng，平端限制性内切酶3U，T4DNA连接酶70U，T4DNA连接酶缓冲液1×，不对称接头序列50μM，加ddH2O到10μl，25℃，反应6-16个小时。所述平端限制性内切酶可为Dra I、EcoR V、Bal I、Pvu II、Sma I、Sna I或Stu I。所述不对称接头序列具体可为由具有序列表中序列1的单链寡核苷酸序列(ADA1)和具有序列表中序列2的单链寡核苷酸序列(ADA2)加热到80℃，然后在室温下冷却，退火而成的双链接头。步骤2)中所述两轮嵌套引物PCR扩增中，第一轮PCR扩增的引物对可为具有序列表中序列3的单链寡核苷酸序列和序列4的单链寡核苷酸序列；第二轮PCR扩增的引物对可为具有序列表中序列5和序列6的单链寡核苷酸序列。为了便于DNA回收和序列测定，两轮嵌套引物PCR扩增的反应体系均可为40μl。其中，所述第一轮PCR扩增的反应体系可为酶切连接液2μl，rTaq酶4U，正反向引物各0.3μM，dNTP 175μM，1×PCR缓冲液(可购自大连宝生物工程有限公司，TaKaRa)，加双蒸水到40μl；所述第二轮PCR扩增的反应体系可为第一轮PCR产物50倍稀释液3μl，rTaq酶1.5U，正反向引物各0.5μM，dNTP 115μM，1×PCR缓冲液，加双蒸水到40μl。所述两轮嵌套引物PCR扩增的反应条件均可为94℃下预变性3min；然后94℃下变性30s，67℃下退火45s，72℃下延伸2.5min，循环35次；72℃下充分延伸5min。本专利技术的扩增水稻T-DNA插入位点侧翼序列的方法，具有如下特点1)酶切与连接在同一反应体系中常温下进行，简洁快速，大大节省了反应试剂和反应时间；2)不对称性接头和嵌套的PCR保证了扩增的特异性；不对称性接头由于短链3’端具有NH2基团，防止了接头引物的结合位点产生，接头引物的结合位点只有在T-DNA引物下扩增出来；即使扩增出两端具有接头序列的片段，也会由于末端反向重复序列在退火时形成手性结构而抑制扩增；3)平端限制性内切酶(如Dra I或EcoR V)在T4连接酶缓冲液的10μl体系中能够充分酶切；4)在单酶切条件下，仅用左边界引物和接头引物就能达到扩增效率85％，远高于一般方法的扩增效率；5)第二次PCR反应体系达到40μl大大提高了产率，利于DNA回收和序列测定。该方法适用于高通量水稻基因组分析。附图说明图1为PCR-walking技术扩增T-DNA侧翼序列原理示意2为增强子捕捉质粒pFX-E24.2-15R的物理图谱具体实施方式以下实施例中的实验方法如无特别说明均为常规方法。实施例1、水稻T1代T-DNA插入突变体的侧翼序列扩增1、水稻T1代T-DNA插入突变体的获得水稻遗传转化所用的T-DNA双元载体为含有GAL4-VP16-GUS增强子捕获元件的增强子捕获载体pFX-E24.2-15R(购自澳大利亚CAMBIA研究中心)。载体的物理图谱如图2所示，T-DNA右边界内有由基础35S启动子驱动的GAL4-VP16元件。GAL4的结合位点在长度上是UAS的六倍。UAS的下游是GUS基因。T-DNA区携带有质粒挽救所需的pUC-ori和氨苄青霉素抗性基因。植物转化体的选择标记基因——潮霉素-3’NOS——连在T-DNA左边界邻接的地方，由35S启动子驱动。细菌中的选择抗性基因——氯霉素抗性基因在T-DNA左边界(LB)外边。图2中，T BORDER(L)T-DNA区左边界；T BORDER(R)T-DNA区右边界；CAM RESISTANCE氯霉素抗性基因；CAMV35S35S启动子；HYG(R)潮霉素抗性基因；POLY A SITEPoly A位点；Amp氨苄青霉素抗性基因；BoGUS葡糖醛酸酶基因；GFP绿色荧光蛋白基因；EGFP增强的绿色荧光蛋白基因；6xUAS6段重复的上游激活序列；GAL4/VP1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种扩增水稻Ｔ－ＤＮＡ插入位点侧翼序列的方法，包括以下步骤：１）酶切连接：在同一反应体系中，利用平端限制性内切酶酶切水稻基因组ＤＮＡ并利用Ｔ↓［４］ＤＮＡ连接酶将得到的酶切片段与不对称接头序列连接，得到酶切连接液；所述不对称接头序列 为由一条长链和一条短链组成的双链接头，长链和短链互补，并且在水稻基因组中无同源序列，长链具有至少两个嵌套引物的结合位点；２）以步骤１中的酶切连接片段为模板，以根据所述不对称接头序列和Ｔ－ＤＮＡ的左边界序列设计的嵌套引物进行两轮嵌套引 物ＰＣＲ扩增，得到Ｔ－ＤＮＡ插入位点侧翼序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：路铁刚，彭昊，杨永智，吴金霞，黄红梅，宛淑艳，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]