本发明专利技术属于分子生物学试剂制备技术领域，具体公开了一种100bp梯度DNA分子量标志物的制备方法。所述方法采用无缝克隆与聚合酶链式反应相结合的方法，具体包括如下步骤：以10个重组质粒为模板，用1对特异性引物，在有PCR mix存在的条件下，在PCR仪上，在同一个PCR扩增条件下进行聚合酶链式反应，同时合成10条DNA片段，所得DNA带的长度分别为：400bp、500bp、600bp、800bp、900bp、1000bp、1150bp、1300bp、1500bp、2200bp，再经纯化、混合而成。本发明专利技术的特点是能按预定目标快速、精确、大量地制备用于DNA分子量标志物的不同长度的DNA分子。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学试剂制备
，具体涉及一种IOObp梯度DNA分子量 标志物的制备方法。
技术介绍
在DNA合成及各种方式的基因操作过程中，需要对合成的或进行操作的DNA分子 大小变化进行监测，常用的方法是通过将待测DNA分子与一种已知分子量的DNA混合标准 物质同时进行电泳，通过比较待测DNA分子与DNA分子标准物质在电泳过程中的迀移程度 来判断待测DNA分子的大小。因此需要制备一些已知分子量的标准DNA。制备标准DNA的 常用方法有以下4种： 化学合成法：是通过化学反应的方法将4种不同的脱氧核糖核苷酸结合在一起， 合成目标大小的DNA片段。但是此方法操作繁琐、效率低、合成DNA长度受限。 片段连接法：是先用化学合成法合成一些小分子量的DNA分子，再用酶促连接反 应将小分子DNA -个个逐步连接起来，形成不同大小的DNA分子。理论上合成DNA长度不 限，但操作繁琐，无法实现大规模制备。 酶切法：是用一种或者两种限制性内切酶对噬菌体DNA，质粒进行切割，产生不同 大小的DNA片段，作为分子量标志，此方法的缺陷是酶切产生的DNA片段大小受所用限制性 内切酶的限制，难以形成像IOObp整数倍的DNA片段且DNA分子的制备和纯化过程比较复 杂，成本高且产率低。 聚合酶链式反应（PCR法）：此方法可实现任意分子量大小的DNA片段、模板来 源不受限制、成本低、可规模化生产且快速便捷，已广泛用于基因克隆和DNA片段的制备。 目前国内的专利中有一公开的专利是利用此方法制备IOObp分子量的标志物，专利号： 200410103204. 4。但是此方法仍然使用11对特异性的引物分别对11个片段进行扩增，操 作复杂。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于针对现有技术的不足，设计一种IOObp梯度DNA分子量标 志物的制备方法。所述方法采用无缝克隆与聚合酶链式反应相结合的方法，以重组质粒为 模板，使用1对特异性引物分别对目标DNA片段进行扩增，简化了操作步骤，且能按预定目 标快速、精确、大量地制备用于DNA分子量标志物的不同长度的DNA分子。 本专利技术提供一种IOObp梯度DNA分子量标志物的制备方法，采用无缝克隆与聚合 酶链式反应相结合的方法，具体包括如下步骤：以10个含有DNA片段的重组质粒为模板，用 1对特异性引物，在有PCR mix存在的条件下，在PCR仪上，在同一个PCR扩增条件下进行 聚合酶链式反应，同时合成10条DNA片段，所得DNA带的长度分别为：400bp、500bp、600bp、 800bp、900bp、1000 bp、1150bp、1300bp、1500bp、2200bp，再经纯化、混合而成： (1)模板DNA :采用10个含有DNA片段的重组质粒； ⑵1对引物的DNA序列如下： 上游引物-SjF :5' -GGATATCTGTGGATCCGA-3' ； 下游引物-SjR :5' -GGTGGTGGTGCTCGAGTG-3' ； 每条引物溶液的浓度为10 ymol/L ; (3)DNA条带的制备-聚合酶链式反应：取10个PCR用薄壁离心管，分别标上 400bp、500bp、600bp、800bp、900bp、1000 bp、1150bp、1300bp、1500bp、2200bp 的标志，按以下 方案，在每个管中加入聚合酶链式反应用的试剂： 2XPCR mix 50 μΙ·, 卜.游弓丨物-SjF 2,5 μι, ΙΟμηιοΙ/L； 卜游4??-?R 2.5 μL. !0 ^iraoizL； 重组质粒DNA 0.1 pL： 加去离子水至总体积为 100 μL; (4)扩增反应条件为 ％°C 5min ;%°C 3〇sec，6〇°C 3〇sec，72°C I. 5min，共 3〇 个循 环；72°C延伸 lOmin，10°C保存； (5)扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，确定片段大小； (6)片段确定后，使用PCR产物纯化试剂盒对剩余扩增的PCR产物进行纯化，测定 浓度后-20 °C保存备用。 (7) IOObp梯度DNA分子量标志物的构建： 将 400bp、500bp、600bp、800bp、900bp、lOOObp、1150bp、1300bp、1500bp、2200bp 共 10条DNA片段溶于TE缓冲液中，将含有DNA的溶液与6 X DNA上样缓冲液以5:1的比例配 制、混匀，使500bp、lOOObp、1500bp条带的终浓度为80ng/ μ L，其余条带的终浓度为40ng/ μ L ； 或将 500bp、800bp、1000bp、1300bp、1500bp、2200bp 共 6 条 DNA 片段溶于 TE 缓冲 液中，将含有DNA的溶液与6 X DNA上样缓冲液以5:1的比例配制、混匀，使500bp、1000 bp、 1500bp条带的终浓度为80ng/ μ L，其余条带的终浓度为40ng/ μ L。 进一步的，所述6XDNA上样缓冲液包括：30mmol/L EDTA，体积分数36%的丙三 醇，质量分数〇. 05 %的溴酚蓝，质量分数0. 05 %的二甲苯氰FF。 进一步的，所述10个重组质粒的制备方法包括如下步骤： (1)提取日本血吸虫成虫基因组DNA ; (2)筛选模板DNA :以含有信号肽、具有跨膜结构编码蛋白以及胞外段编码大于 110个氨基酸为筛选标准，通过Schistodb数据库选取10个基因，具体基因序列如下： 400bp 基因 Sjp_0104440 序列如 SEQ ID NO: 1 所示； 500bp 基因 Sjp_0133040 序列如 SEQ ID N0:2 所示； 600bp 基因 Sjp_0073840 序列如 SEQ ID N0:3 所示； 800bp 基因 Sjp_0117070 序列如 SEQ ID N0:4 所示； 900bp 基因 Sjp_0097450 序列如 SEQ ID N0:5 所示； 1000 bp 基因 Sjp_0042690 序列如 SEQ ID N0:6 所示； 1150bp 基因 Sjp_0072390 序列如 SEQ ID N0:7 所示； 1300bp 基因 Sjp_0121630 序列如 SEQ ID N0:8 所示； 1500bp 基因 Sjp_0007620 序列如 SEQ ID N0:9 所示； 2200bp 基因 Sjp_0004440 序列如 SEQ ID NO: 10 所示； (3)设计无缝克隆引物； (4)构建重组质粒。 进一步的，所述设计无缝克隆引物的方法包括如下步骤：以上述10个基因 DNA序 列信息为基础，根据无缝克隆原理设计无缝克隆引物，所述引物长度限定在15~35bp，所 述引物5'端包含与载体pET32c(+)末端相同的18个碱基序列，具体的无缝克隆引物如下： 400bp基因 Sjp_0104440无缝克隆上游引物序列如SEQ ID NO: 11所示； 400bp基因 Sjp_0104440无缝克隆下游引物序列如SEQ ID NO: 12所示； 500bp基因 Sjp_0133040无缝克隆上游引物序列如SEQ ID NO: 13所示； 500bp基因 Sjp_0133040无缝本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种100bp梯度DNA分子量标志物的制备方法，其特征在于，采用无缝克隆与聚合酶链式反应相结合的方法，具体包括如下步骤：以10个含有DNA片段的重组质粒为模板，用1对特异性引物，在有PCR mix存在的条件下，在PCR仪上，在同一个PCR扩增条件下进行聚合酶链式反应，同时合成10条DNA片段，所得DNA带的长度分别为：400bp、500bp、600bp、800bp、900bp、1000bp、1150bp、1300bp、1500bp、2200bp，再经纯化、混合而成：(1)模板DNA：采用10个含有DNA片段的重组质粒；(2)1对引物的DNA序列如下：上游引物‑SjF：5’‑GGATATCTGTGGATCCGA‑3’；下游引物‑SjR：5’‑GGTGGTGGTGCTCGAGTG‑3’；每条引物溶液的浓度为10μmol/L；(3)DNA条带的制备‑聚合酶链式反应：取10个PCR用薄壁离心管，分别标上400bp、500bp、600bp、800bp、900bp、1000bp、1150bp、1300bp、1500bp、2200bp的标志，按以下方案，在每个管中加入聚合酶链式反应用的试剂：(4)扩增反应条件为95℃5min；95℃30sec，60℃30sec，72℃1.5min，共30个循环；72℃延伸10min，10℃保存；(5)扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，确定片段大小；(6)片段确定后，使用PCR产物纯化试剂盒对剩余扩增的PCR产物进行纯化，测定浓度后‑20℃保存备用。(7)100bp梯度DNA分子量标志物的构建：将400bp、500bp、600bp、800bp、900bp、1000bp、1150bp、1300bp、1500bp、2200bp共10条DNA片段溶于TE缓冲液中，将含有DNA的溶液与6×DNA上样缓冲液以5:1的比例配制、混匀，使500bp、1000bp、1500bp条带的终浓度为80ng/μL，其余条带的终浓度为40ng/μL；或将500bp、800bp、1000bp、1300bp、1500bp、2200bp共6条DNA片段溶于TE缓冲液中，将含有DNA的溶液与6×DNA上样缓冲液以5:1的比例配制、混匀，使500bp、1000bp、1500bp条带的终浓度为80ng/μL，其余条带的终浓度为40ng/μL。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李健，
申请(专利权)人：湖北医药学院，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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