胰岛素抗性细胞及其转变方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种将胰岛素敏感性细胞转变为胰岛素抗性细胞的方法，包括步骤：ａ）用糖浓度为０－０．１毫克／毫升的低糖培养液培养敏感性的胰岛素受体细胞至稳定；ｂ）在培养液中加入胰岛素和葡萄糖，继续培养；ｃ）２－８日后，增加培养液中葡萄糖和胰岛素的浓度，继续培养细胞２０－４０天。本发明专利技术还提供了用这种方法转变的细胞及其应用。运用本发明专利技术可以简便迅速的筛选对ＩＩ型糖尿病具有疗效的药物。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及胰岛素抗性细胞，特别是通过诱导将胰岛素敏感性细胞转变为胰岛素抗性的方法。本专利技术还涉及转变的细胞的鉴定方法及其在药物筛选中的用途。
技术介绍
糖尿病是一种常见的内分泌疾病，影响糖类代谢和血糖水平，导致高发病率和死亡率，并导致病人个人和卫生系统可观的经济消耗。该疾病有几种形式。I型糖尿病(胰岛素依赖性糖尿病或IDDM)是一类自身免疫病，病人体内出现针对胰岛细胞的抗体，错误的将胰脏β细胞当成入侵者加以破坏和清除，从而阻止内源性胰岛素的产生，需要在病人余生中用外源性胰岛素治疗。通常发病于儿童期。用胰岛素或饮食和降血糖药物治疗可使症状减轻，但常常不能防止该病的血管并发症，如早熟性冠心病。II型或成年发生的糖尿病可能是饮食引起的。II型糖尿病是随着年龄增长越来越普遍的疾病。其最初特征是对胰岛素敏感性的降低，和循环胰岛素浓度的代偿性上升，后者是维持正常血液糖原水平必需的。胰腺β细胞分泌的增加使胰岛素水平提高，导致的高胰岛素血症是与糖尿病的心血管并发症相关的。随着胰岛素抗性恶化，对胰腺β细胞的要求稳定提高，直到胰腺再不能提供足够水平的胰岛素，导致血糖水平提高。最终，发生明显的高血糖和高血脂，导致与糖尿病有关的破坏性的长期并发症，包括心血管疾病、肾衰竭和失明。尚未了解导致II型糖尿病的确切机制，但该机制导致糖原运输、骨骼肌肉受到损害，肝糖原生产增加和胰岛素应答不充分。膳食改善通常是无效的，因此大多数病人最终需要药物干涉，来有效防止和/或减缓疾病并发症的发展。可用一种或多种可行的口服抗-糖尿病药剂治疗病人，来提高胰岛素分泌。但是目前所用的药物可能有副作用。目前研究和治疗糖尿病的热点主要有二一是各种低糖低脂的食物，但饮食不能根本改善或消除糖尿病的症状。另一种是各种能够降糖的药物和器具。而能够真正阐述II型糖尿病病因以及可高效筛选抗II性糖尿病药物的方法、材料和模型很少见。II型糖尿病的治疗目前主要着重于提高人体细胞对胰岛素的敏感，而这种提高是着重于胰岛素反应的信号途径上，包括P13K和PKB。因此，本领域迫切需要开发胰岛素抗性细胞模型，以便进行II型糖尿病的研究。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种可用于II型糖尿病的研究的胰岛素抗性细胞模型，及其在筛选药物方面的应用。一方面，本专利技术提供了一种将胰岛素敏感性的胰岛素受体细胞转变成胰岛素抗性的方法，该方法包括步骤a)用糖浓度为0-0.1毫克/毫升的低糖培养液培养敏感性的胰岛素受体细胞至稳定；b)在培养液中加入胰岛素和葡萄糖，继续培养；c)2-8日后，增加培养液中葡萄糖和胰岛素的浓度，继续培养细胞20-40天。本专利技术还提供了用上述方法转变的胰岛素抗性的胰岛素受体细胞。在一个优选例中，用上述方法转变的胰岛素受体细胞是人脂肪母细胞。在另一个优选例中，用上述方法转变的细胞用于筛选II糖尿病药物。本专利技术还提供了一种筛选II型糖尿病药物的方法，该方法包括在用上述方法转变细胞的过程中，加入要检测的药物，观察待转变的细胞中糖原水平的变化；或在已转变的上述细胞中加入要检测的药物，培养一段时间，观察细胞中糖原水平的变化。附图说明图1显示了糖原染色免疫组织化学分析图的标准。其中-，阴性，细胞结构清晰，无紫红色糖原颗粒；+，弱阳性，细胞结构清晰，紫红色糖原颗粒约占细胞面积的1/3左右。++，中阳性，细胞结构尚可辨，紫红色糖原颗粒约占细胞面积的1/2-2/3。+++，强阳性，细胞结构不可辨，紫红色糖原颗粒约占细胞全面积。图2是对实施例2的细胞进行PKS活性检测的结果。图3是对实施例3的细胞进行PKS活性检测的结果。图4是未转化的对照组细胞和实施例2、实施例3的培养细胞糖原染色的免疫组织化学分析图。图5是泽泄预防细胞产生胰岛素抗性的实验数据图。图6是泽泄对逆转细胞胰岛素抗性的实验数据图。具体实施例方式胰岛素敏感性细胞的转变方法一种将胰岛素敏感性的胰岛素受体细胞转变成胰岛素抗性的方法，其特征在于，该方法包括步骤a)用糖浓度为0-0.1毫克/毫升的低糖培养液培养敏感性的胰岛素受体细胞至稳定；b)在培养液中加入胰岛素和葡萄糖，继续培养；c)2-8日后，增加培养液中葡萄糖和胰岛素的浓度，继续培养细胞20-40天。本专利技术步骤b)所用的培养液中加入的起始胰岛素浓度优选为2-10国际单位/毫升，葡萄糖浓度为0.2-0.5毫克/毫升或以上，最优选的本专利技术步骤b)中的起始胰岛素浓度为4国际单位/毫升，葡萄糖浓度为0.25毫克/毫升。在本专利技术方法中，通常通过从约第5日起每隔3-7天，较佳地每隔4-6日逐渐增加培养液中的葡萄糖和胰岛素浓度，例如每隔5天增加浓度各1倍，以便胰岛素受体细胞从敏感性转变成抗性。通常，在培养20-40天，优选25-35天后，胰岛素受体细胞就会从敏感性转变成抗性。本专利技术还提供了用上述方法转变的胰岛素抗性细胞。在一个优选例中，用上述方法转变的细胞是人脂肪母细胞。本文所用的“胰岛素敏感性细胞”是人类表达胰岛素受体细胞，包括表达胰岛素受体的脂肪细胞和肌肉细胞。本专利技术用于转变的优选表达胰岛素受体的细胞是胰岛素敏感型的人脂肪母细胞。在本文中，“胰岛素抗性细胞”和“胰岛素抗性受体细胞”可互换使用，都指表达人类表达胰岛素受体，但对胰岛素不敏感的细胞，例如当胰岛素敏感性细胞对胰岛素的感受性从敏感性转变为不敏感后，就成为胰岛素抗性细胞。胰岛素敏感性细胞可以与胰岛素结合，激活P13K(磷酸肌醇3-激酶)。P13K又通过复杂的机制激活PKB(蛋白质激酶B，又称为Aktβ)。PKB在糖代谢中起关键作用，一方面它能抑制细胞内源肝糖合成，另一方面能激活葡萄糖转运体来促使血糖向细胞内的运输，使得血糖水平迅速下降。II型糖尿病病人本身能分泌胰岛素，但是由于体内产生对胰岛素的抗性，导致血中葡萄糖水平偏高，产生糖尿病症状。一般公认这种现象与PKB功能损伤有关(Han Cho等，InsulinResistance and a Diabetes Mellitus-Like Syndrome in Mice Lacking the ProteinKinase Akt2(PKB)，Science，1999年1月)。研究人员发现，在小鼠中将PKB基因敲除，可使小鼠表现出胰岛素抗性和不可抑制的产生肝糖，出现糖尿病症状。由此可见，胰岛素抗性与PKB功能损伤有关。胰岛素抗性细胞的检测方法在本专利技术中，可通过PKB活性检测和细胞内糖原含量的免疫组织化学来检测细胞的诱变转型。1.PKB活性检测如上所述，由于胰岛素抗性与PKB功能损伤有关，因此对诱导的细胞进行PKB活性检测，可鉴定细胞是否发生了由胰岛素敏感型向胰岛素抵抗型的转变。用商品化的磷酸激酶测试试剂盒，使用常规方法，如酶的显色反应和蛋白质印迹法进行活性分析。2.细胞内糖原含量的测试方法细胞如在人为诱导下发生由胰岛素敏感型转变为胰岛素抵抗型，则细胞在胰岛素存在下对外周糖的敏感、摄取和利用也会大大下降，直接导致细胞内糖类和脂肪水平比未转变前的细胞下降了4-5倍，是糖尿病的表征之一，该检测方法具有直观的优点。在本专利技术中，可用常规糖原染色的试剂对细胞进行常规染色(组织化学手册，人民卫生出版社，北京，1982，陈啸梅等编)，或者用显微分光光度仪对染色细胞的透光度进行扫描，计算胞内糖原的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种将胰岛素敏感性的胰岛素受体细胞转变成胰岛素抗性的方法，其特征在于，该方法包括步骤：ａ）用糖浓度为０－０．１毫克／毫升的低糖培养液培养敏感性的胰岛素受体细胞至稳定；ｂ）在培养液中加入胰岛素和葡萄糖，继续培养；ｃ）２－８日后，增 加培养液中葡萄糖和胰岛素的浓度，继续培养细胞２０－４０天。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴超群，高瑞兰，钟翠平，郭红卫，
申请(专利权)人：上海复旦金科生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]