一种人胎盘间充质干细胞的分离方法技术

本发明专利技术公开了一种人胎盘间充质干细胞的分离方法。本发明专利技术的发明专利技术人在总结以往分离组织细胞的基础上，利用胎盘特殊的解剖结构，采用灌流法，成功自胎盘中分离获得纯度较高的ＭＳＣ。鉴定结果表明从胎盘中分离的间充质干细胞与以往报道的骨髓间充质干细胞具有相同的生物学特性和多向分化能力。由于胎盘与脐血一样，细胞成分较幼稚，来源广泛，方便易得，因此在临床上将具有广泛的应用前景。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种细胞的分离方法，具体地说涉及。
技术介绍
人间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)是最早自骨髓中分离出的一类具有多向分化潜能及自我更新能力的组织干细胞，来源于胚胎发生期的中胚层，在体内和体外特定条件下可向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、肌腱细胞、肝细胞甚至神经胶质细胞分化(1.Caplan AI.Mesenchymalstem cells.J Orthop Res.1991，9641-650.2.Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC，et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.Science.1999；284143-147.)。MSC易于从骨髓中分离纯化，进行有效的体外扩增，对其生物学作用研究结果表明，MSC具有改善骨髓微环境，促进造血移植后造血重建的作用(1.Kadereit S，Deeds LS，Haynesworth S，et al.Expansion ofLTC-ICs and Maintenance of p21 and BCL-2 Expression in Cord BloodCD34+/CD38-Early Progenitors Cultured over Human MSCs as a Feeder Layer.Stem cell.2002；20573-582.2.Koc ON，Gerson SL，Cooper BW，et al.Rapidhematopoietic recovery after coinfusion of autologous-blood stem cells andculture-expanded marrow mesenchymal stem cells in advanced breast cancerpatients receiving high-dose chemotherapy.J Clin Oncol.2000；18307-316.3.Klyushnenlova E，Mosca J，McIntosh K.Human mesenchymal stem cells suppressallogeneic T cell responses in vitroimplications for allogeneic transplantation.Blood.1998；92642a.)。免疫特性方面，MSC不表达或仅表达可忽略水平的MHC II类分子，不相关供者的MSC不引起异体淋巴细胞反应，能下调异体免疫反应(1.McIntosh K，Klyushnenkova E，Shustova V，et al.Suppression ofalloreactive T cell reaponse by human mesenchymal stem cells involves CD8+cells.Blood.1999；94133a.2.Klyushnenkova E，Shustova V，Mosca J，et al.Human mesenchymal stem cells induce unresponsiveness in preactivated but notnative alloantigen specific T cells.EXP Hematol.1999；27122.)。基于上述特征，使其从发现后迅速成为在细胞治疗、基因治疗中有效发挥作用的理想工程细胞，以及组织工程尤其是骨或软骨组织损伤修复中重要的种子细胞。目前所报道的MSC主要来源于骨髓，采用密度梯度离心法获得。虽然分离方法简便，但供者取髓需经历一个比较痛苦的手术，并在取材过程中及取材后会有很高的感染机会；由于人体骨髓中MSC的含量极其稀少，每105～106个单个核细胞中大约只有1个，且随着年龄的增加，骨髓中MSC的数量、增殖和分化能力均显著下降(Rao MS，Mattson MP.Stem cells and agingexpanding the possibilities.Mech Ageing Dev.2001；122713-734.)，使其在研究和应用尤其是临床应用中受到限制。最近，已有具有干祖细胞特性的间充质细胞自包括骨、软骨、肌肉、腱等组织中分离出来(1.Ralf H.Isolation of Primary and Immortalized CD34-Hematopoietic and Mesenchymal Stem Cells from Various Sources.StemCells.2000；181-9.2.Deans RJ，Moseley AB.Mesenchymal stem cellsbiology andpotential clinical uses.Exp Hematol.2000；28875-884.)，这些组织有一个共同的特征就是来源于胚胎发育期的中胚层。起源于胚胎发育期胚外中胚层的胎盘是由间质、血管及滋养细胞组成，含有大量的间充质成分。在胚胎发育时期，胚外中胚层的多能干细胞可能有少量的未被招募发生分化，而以静止形式存在于胎盘组织中，如果能从胎盘中分离培养出MSC，将为实验研究和临床应用开辟一个崭新而丰富的来源。2000年美国血液学年会，Jaroscak等报道采用酶消化法，将胎盘组织用手术剪刀剪碎，加组织酶消化一定时间后，过滤获得细胞悬液，接种于培养基中，经过一段时间培养后，可见培养瓶中有贴壁细胞，继续培养，获得的胎盘贴壁细胞采用流式细胞术检测细胞表面标志，结果显示获得的胎盘贴壁细胞与骨髓MSC在细胞表面标志染色特性上没有明显区别，但胎盘贴壁细胞是异质性的，细胞表面标志SH2，SH3，SH4等为阳性；不表达CD45，PECAM，提示其为非造血细胞及内皮细胞，说明胎盘中存在MSC成分(Jaroscak J，Smith T，Haynesworth S，et al.Preliminary characterization of the surface stainingof placental derived adherent cellsA potential new souece of stroma for umbilicolcord blood(UCB)expansion.THE AMERICAN SOCIETY OFHEMATOLOGY，December 1-5，2000.)。2002年日本学者Watanabe等采用酶消化法或组织培养法结合流式细胞术分选法从胎盘中分离出MSC，具体方法主要为将胎盘组织剪碎，组织酶消化或直接组织块培养，流式细胞仪分选所需细胞，继续培养一段时间后，进行细胞生物学鉴定并诱导细胞向成脂肪、成骨和成软骨分化，进一步诱导细胞向神经细胞分化(Watanabe N，Igura K，Nagamura-Inoue T，et al.Multilineage potential of human placenta-derivedmesenchymal cells.THE AMERI本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离人胎盘间充质干细胞的方法，包括以下步骤：（１）在无菌条件下，自脐血管插入导管形成循环液体灌流系统；（２）先用灌流液通过动静脉循环将残留的血液洗出，然后用灌流液孵育；（３）从灌流液中分离单个核细胞，进行培养；　 　（４）用胰酶消化传代进行鉴定。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张毅，李长东，江小霞，何津，刘元林，张双喜，吴英，毛宁，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]