【技术实现步骤摘要】
本申请属于生物，尤其是指用于检测esr1基因突变的寡核苷酸组及其应用。
技术介绍
1、乳腺癌(hr)是一种发生在乳腺上皮组织的恶性肿瘤，是女性最常见的恶性肿瘤。2020年世界卫生组织国际癌症研究机构(iarc)最新数据显示，乳腺癌新增人数达226万，正式取代肺癌，成为全球第一大癌症。乳腺癌分子水平上具有高度异质性，激素受体阳性(hr)乳腺癌约占全部乳腺癌的65％-70％，内分泌治疗是hr患者首选的治疗方案。然而，当前面对的最大临床挑战是内分泌治疗的耐药现象，几乎所有hr乳腺癌患者最终都会出现内分泌治疗耐药和疾病进展。研究证明，雌激素受体(er)的α基因(esr1)突变是使抗肿瘤治疗产生耐药性的重要驱动因素，esr1基因变异包括扩增、重排和点突变等多种形式，esr1突变引起er活性的提高和表达上调，能够产生不依赖雌激素的自发活性。研究表明，esr1基因编码erα蛋白，erα蛋白的配体结构域(lbd)是蛋白与雌激素结合的部位，在er促进细胞增殖的过程中发挥重要功能。erα突变热点主要是位于lbd结构域中第537位酪氨酸、第538位天冬氨酸以及第380位谷氨酸的附近。这些位置的突变可能造成蛋白构象改变，引起非配体依赖的er信号通路激活，最终可能导致内分泌治疗耐药、促进肿瘤远端转移。
2、由于发生以上突变，造成乳腺癌患者很容易耐药，故需从明确诊断激素受体阳性乳腺癌开始，就要进行esr1基因突变的检测。检测贯穿整个内分泌治疗的过程，为激素受体阳性乳腺癌患者构建合理的筛查及监测系统，尽早检测出esr1基因突变，以便及时调整为更好
3、基于临床实验和临床诊疗中对于esr1基因突变检测存在同时检测lbd内多区段多位点多态性突变并高检测灵敏度的需求。我们排除了ddpcr、arms+rt-pcr、illuminangs和基于二代测序的靶向测序，选择从目前广泛应用于医院检验科的焦磷酸测序检测技术进行技术突破。焦磷酸测序技术(pyrosequencing)作为一种新型的基于四种酶的级联反应进行定量序列分析的测序技术，适于对短序列的测序分析，其通过对病人样本dna序列的直接测定，与已知dna序列进行对照，从而对乳腺癌病人的病情作出判断。不仅可以指导临床用药，还可以对未来的病情发展作出预测，目前焦磷酸测序技术广泛应用在耐药分析、肿瘤个性化治疗和病毒分型等方向中。由于焦磷酸测序法能直接得到目的核苷酸片段，被称为分子诊断中的“金标准”。
4、虽然单独使用焦磷酸测序，即时性较好，但依然存在检测灵敏度不足的问题，提升其检测灵敏度的文献记载方法中，往往是针对每个点突变设计对应引物或探针，将扩增步骤复杂化难以实现临床上的实际应用。
5、焦磷酸测序存在的问题，主要在于灵敏度不够和扩增体系过于复杂。我们设计了两组特异性阻遏探针和配对引物对esr1多个突变基因进行靶向扩增，借此，提升焦磷酸测序的检测灵敏度和实现同时检测基因多点突变的目的。
技术实现思路
1、鉴于esr1功能突变区配体结合结构域(lbd)独特的变异特点，专利技术人结合焦磷酸测序，设计了以阻遏探针为核心的多点突变靶向扩增体系，可抑制野生型序列扩增和有效地大量扩增突变序列。
2、为实现以上目的，本申请首先提供用于检测雌激素受体基因α(esr1)突变的寡核苷酸组，其由seq id no:1所示核苷酸序列的上游引物、seq id no:2所示核苷酸序列的下游引物和seq id no:3所示核苷酸序列的探针组成；和/或由seq id no:4所示核苷酸序列的上游引物、seq id no:5所示核苷酸序列的下游引物和seq id no:6所示核苷酸序列的探针组成。
3、在pcr体系中，上游引物、所述下游引物和所述探针的使用比例为fprimer:rprimer≤1且switch:rprimer≥1，优选为1:2-10:5-10。
4、进一步地，探针序列的3'末端具有能够阻止3'端外切酶和3'端聚合酶发挥作用，从而阻止探针直接延伸的修饰基团。可选地，集团为c3spacer(间臂)。
5、进一步地，探针的5'端与上游引物3'有1-5bp的距离间隔。
6、在本申请的一些实施方案中，使所述探针的退火(熔解)温度比突变检测引物的退火温度高1-10℃。可选地，探针的熔解温度(tm)值比所述突变检测引物的熔解温度(tm)值高1-6℃。
7、在本申请的一些实施方案中，上述各个引物在pcr扩增体系中的终浓度为0.2-2.5um。
8、本申请通过以上两组上下游引物和特异性探针的组合，有效阻止了含有微量突变序列的野生与突变混合序列中的占绝对优势数量的野生序列扩增，仅靶向大量扩增突变型基因序列；并且能有效扩增多点突变序列，以提供焦磷酸测序所用的dna模板。
9、其次，本申请还提供上述核苷酸组在制备检测雌激素受体(er)的α基因(esr1)突变的试剂盒中的应用。
10、然后，本申请提供一种阻遏探针介导的检测esr1基因多点突变的试剂盒，试剂盒包括seq id no:1所示核苷酸序列的上游引物、seq id no:2所示核苷酸序列的下游引物和seq id no:3所示核苷酸序列的探针；和/或seq id no:4所示核苷酸序列的上游引物、seqid no:5所示核苷酸序列的下游引物和seq id no:6所示核苷酸序列的探针；引物经硫代修饰和探针经多种修饰方式修饰，例如3'末端具有能够屏蔽引物直接延伸的基团，例如是间臂类修饰c3spacer。以及pcr的预混体系；具体地，预混体系包括taqdna聚合酶、pcr缓冲液和dntps混合物。
11、使用试剂盒中的引物、探针组合以及酶等，能有效阻止混合样本中占优势数量比的野生型序列扩增，仅大量扩增微量的突变型序列。由此，能够实现esr1小区段高异质性lbd突变区的单位点多态性、痕量、多位点突变的便捷、高即时性、高灵敏度检测，以更低成本监控乳腺癌患者的病情变化。
12、最后，本申请提供阻遏探针和引物检测esr1突变基因的方法，基因突变的检测方法包括以下步骤：
13、将seq id no:1所示核苷酸序列的上游引物、seq id no:2所示核苷酸序列的下游引物和seq id no:3所示核苷酸序列的探针和/或seq本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于检测雌激素受体α基因突变的寡核苷酸组，其特征在于，由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物、SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物和SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的探针组成；和/或
2.根据权利要求1所述的寡核苷酸组，其中，所述核苷酸序列经过修饰。
3.根据权利要求1所述的寡核苷酸组，其中，所述探针的5'端与上游引物的3'端在序列上的结合位置至少有1-5bp的间隔距离。
4.根据权利要求1所述的寡核苷酸组，其中，所述探针的熔解温度比所述引物的熔解温度高1-6℃。
5.根据权利要求1所述的寡核苷酸组，其中，所述上游引物、所述下游引物和所述探针的使用比例为1:2-10:5-10。
6.根据权利要求1-5任一项所述的寡核苷酸组，在制备检测雌激素受体α基因突变试剂盒中的应用。
7.包括权利要求1-5任一项所述寡核苷酸组的试剂盒，所述试剂盒用于检测雌激素受体α基因突变。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括含有Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液和dNTPs的P
9.一种利用权利要求1-5任一所述寡核苷酸组检测雌激素受体α基因突变的方法，步骤如下：
10.根据权利要求9所述的方法，其中，在将所述PCR扩增体系置于所述PCR仪中进行所述PCR反应得到所述PCR产物的过程中，退火/延伸温度为50-55℃维持1分钟，且不少于35-40个循环；所述混合物在所述PCR扩增体系中的最终浓度是0.2-2.5uM。
...【技术特征摘要】
1.用于检测雌激素受体α基因突变的寡核苷酸组，其特征在于，由seq id no:1所示核苷酸序列的上游引物、seq id no:2所示核苷酸序列的下游引物和seq id no:3所示核苷酸序列的探针组成；和/或
2.根据权利要求1所述的寡核苷酸组，其中，所述核苷酸序列经过修饰。
3.根据权利要求1所述的寡核苷酸组，其中，所述探针的5'端与上游引物的3'端在序列上的结合位置至少有1-5bp的间隔距离。
4.根据权利要求1所述的寡核苷酸组，其中，所述探针的熔解温度比所述引物的熔解温度高1-6℃。
5.根据权利要求1所述的寡核苷酸组，其中，所述上游引物、所述下游引物和所述探针的使用比例为1:2-10:5-10。
6.根据权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：马飞，钱海利，周彦彤，王文娜，
申请(专利权)人：中国医学科学院肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：
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