本发明专利技术公开了一种焦磷酸测序法检测IRF4基因多态性试剂盒及方法。所述试剂盒对IRF4基因多态性进行检查，具体是指rs872071(A>G)单核苷酸多态性。试剂盒包含如SEQIDNO.2—4所示的引物。本发明专利技术的试剂盒，可以实现准确、快捷、高通量对IRF4基因多态性进行检测，从而达到对慢性淋巴细胞性白血病易感风险的有效预测、预防。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，具体的是涉及焦磷酸测序法检测77 / 基因多态性的试剂盒及方法。
技术介绍
慢性淋巴细胞性白血病(Chronic lymphocytic leukemia, CLL)是影响血液和骨髓的重要癌症之一。在慢性淋巴细胞性白血病时，淋巴细胞(身体内一种抗感染的白血球)不能正常工作。随着时间的推移，有缺陷的淋巴细胞积聚并减少正常的白细胞数目。慢性淋巴细胞性白血病的危险因素尚未完全阐明。慢性淋巴细胞性白血病呈家族性遗传，这表明遗传因素在该病的发生中扮演着重要角色。研究发现，位于人染色体6p25. 3上77 / 基因的3’ UTR的rs872071为慢性淋巴细胞白血病的风险变异，rs872071基因突变通过降低 77 / 表达，阻止记忆B细胞转换，从而增加患病风险(Nat Genet. 2008, 40 (10) : 1204-10)OIRF4基因rs872071位点有3种基因型，AA、AG和GG。G等位基因在普通人群中比例大约为52%，而在慢性淋巴细胞性白血病患者中的比例可达70%。目前多个研究报道证实77 / 基因rs872071的G突变是慢性淋巴细胞性白血病的重要危险因素之一。AG和GG基因型携带者患慢性淋巴细胞性白血病的风险分别为AA基因型的214%和297%。在中国人中进行的大样本研究结果显示，77 / 基因rs872071位点携带一个G等位基因的个体发展为慢性淋巴细胞性白血病的风险是无G等位基因个体的231% (European Journal ofHaematology 2010, 85:492-495)。通过检测77 / 的基因型，可了解是否为慢性淋巴细胞性白血病易感人群，继而从病因学延缓慢性淋巴细胞性白血病的发生、发展；高危人群定期检查，以便早诊断、早治疗、最大程度的降低疾病造成的损害。对于IRF4基因检测高患病风险的人群，应该在饮食、生活、运动、保健、健康体检等方面进行科学合理的安排，以达到降低慢性淋巴细胞性白血病患病风险。综上，IRF4基因多态性对慢性淋巴细胞性白血病疾病的风险评估，尤其是一些特殊人群患病的预测，具有重要的临床意义。开发快速、高效、准确、便捷、经济的检测基因多态性检测试剂盒将为慢性淋巴细胞性白血病的发生起到预测、预防作用。焦磷酸测序(Pyro sequencing)技术是新一代DNA序列分析技术,该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，是一种通用型技术平台。该技术具有操作简便、检测成本低、所需样品量小、快捷、准确、高通量等特点，符合临床大样本检测要求。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种焦磷酸测序法检测IRF4基因(SEQ ID NO. I)多态性的试剂盒及方法，以实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测IRF4 SNP。为了达到上述目的，本专利技术提供的技术方案为一种焦磷酸测序法检测77 / 基因多态性的试剂盒，包括如下引物 (1)扩增引物上游引物5’ -CCGTTTTTGAGACTGATCTCG-3’ (SEQ ID NO. 2)；下游引物5’ -C GGGAATTTCCATTGGAGG-3’ (SEQ ID NO. 3)； 其中，下游引物的5’进行生物素标记； (2)测序引物:5，-GGCCCTTCTCTCACG-3，(SEQID NO. 4)； 试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂。一种应用上述试剂盒检测IRF4基因多态性的方法，包括如下步骤(1)DNA 提取； (2)聚合酶链反应配制 50 μ I PCR 扩增体系，包含10 X PCR buffer 5. 0μ I, dNTP I. 5μ I, 77 / -上游引物 0·5μ1，IRF4 (rs872071)下游引物 O. 5μ 1，rTaqO. 5 μ 1，水 41. O μ 1，模板 I. O μ I ;循环程序为95 oC 5min预变性;依次在95°C 30S,52°C 30S,72°C 30S，进行40个循环；72°C保持5min，最终保持在4 '得扩增产物； (3)焦磷酸测序单链样本纯化； (4)焦磷酸测序及结果分析。本专利技术的试剂盒对77 / RS872071 (A>G)目标序列进行分析和检测，该目标序列包括野生型 AATGTAGCTGAAGTAGAGGGGACGTGAGAGAAGGGCCAGG (SEQ ID NO. 5)和突变型 AATGTAGCTGAAGTAGAGGGGGCGTGAGAGAAGGGCCAGG (SEQ ID NO. 6);扩增出的片段长为 20Ibp。由于设计了特异性高的引物，并且选择了合适的方法，本专利技术的试剂盒适用于对77 / 基因多态性进行快速检测，可广泛应用于临床上对慢性淋巴细胞性白血病发生的预测与预防。与现有技术相比，其应用焦磷酸测序技术可以快速、准确地进行短DNA序列分析，便于构建标准化操作流程；具有高通量、低成本等特点；PCR产物即可直接用于测序，不需进行产物纯化等二次处理，操作极为简便，所需样品量小。附图说明图I为本专利技术77 / (rs872071) (AA)焦磷酸测序结果(注反向测序TT为AA)。具体实施例方式下面结合实施例对上述试剂盒及检测方法进行详细描述。实施例I : IRF4-woY (上游引物)5’ -CCGTTTTTGAGACTGATCTCG-3，(SEQ ID NO. 2)； 7^-pyroR (下游引物)5’ -CGGGAATTTCCATTGGAGG-3’ (SEQ ID NO. 3)； 测序引物:5，-GGCCCTTCTCTCACG-3，(SEQ ID NO. 4)； I. DNA提取 I.I实验前试剂材料准备与检查工作如下 (I)检查试剂盒保质期以及确保Wash Buffer I和2中已添加乙醇，并在瓶上相应标识处打勾V; (2)异丙醇(如无，可用无水乙醇替代)和75%乙醇；(3)高压灭菌有效期内的I. 5mL Eppendorf管和各类移液枪头。I. 2从4°C冰箱中取出装有全血的EDTA抗凝管，上下颠倒数次混匀； I. 3在I. 5mL Eppendorf管对应标本唯一性标识做好标记； I. 4 分别移取 900uL Cell Lysis Solution 加至灭菌的 I. 5mL Eppendorf 管； I. 5小心移取300uL全血转移至上述加有Cell Lysis Solution的I. 5mL EP管； I. 6盖上Eppendorf管盖，室温孵育IOmin ； I. 713, OOOrpm室温离心20秒； I. 8取出Eppendorf管,观察白色沉淀； I. 9开Eppendorf管盖，手持管底部，倾斜EP管口弃去部分红色上清，尽量将红色上清吸尽；· I. 10盖上Eppendorf管,用手指弹击EP管底部,使白色沉淀重悬； 1.11移取300111^ Nuclei Lysis Solution入上述Eppendorf管中，盖上管，上下颠倒数次混匀； I. 12 打开 Eppendorf 管，移取 IOOuL Protein Precipitation Solution 入上述Eppendor本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种焦磷酸测序法检测IRF4基因多态性的试剂盒，其特征在于，包括如下引物：（1）扩增引物：？？？？？上游引物：5’？CCGTTTTTGAGACTGATCTCG？3’；？？？？？下游引物：5’？CGGGAATTTCCATTGGAGG？3’；？？？？？其中，下游引物的5’进行生物素标记；（2）测序引物：5’？GGCCCTTCTCTCACG？3’。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：曹杉，周宏灏，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：
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