特定肉制品的LAMP法检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术特定肉制品的LAMP法检测试剂盒及检测方法涉及一种用环介导等温扩增（LAMP）技术快速检测肉品中是否含有某种被测定肉的技术。试剂盒中包括五组相互独立的A型反应液，即反应液A-1、A-2、A-3、A-4、A-5，还包括能与该五组相互独立A型反应液分别反应的反应液B；以及用该试剂盒分别检测牦牛肉、鸡肉、猪肉、兔肉、羊肉的方法。优点：本试剂盒根据牦牛、鸡、猪、兔、羊五种肉类的基因分别设计了特异性的两种内引物、两种外引物和两种环引物。使用本发明专利技术可快速的对某种肉类或其多种肉混合物制品进行某种肉有无的检测，由于检测速度快，适合作为肉制品掺假的治法工具在基层推广。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于食品生物
，涉及一种用环介导等温扩增(LAMP)技术快速检测肉品中是否含有某种被测定肉的试剂盒，并涉及一种使用该种试剂盒快速检测是否含有被测定肉的方法。
技术介绍
肉制品市场上出现很多低价值的普通肉类掺杂或是替代营养价值和价格都较高的肉类行为，以次充好，对消费者财务和健康都会有损害。尤其是若掺入猪肉，对于回族消费者的宗教信仰都会有影响。因此有必要寻找一种简单快速的方法鉴定肉制品是否有指定的肉和是否有指定不应该有的肉，为鉴定是否有掺假行为提供科学依据。肉种类鉴别方法可以分为形态学、理化学、免疫学和分子生物学。市场上很多的熟 肉制品经过粉碎、添加香料和烘烤等处理后，采用传统的形态学和理化学的方法很难进行准确的肉类品种鉴定。由于肉制品在加工过程中易导致蛋白质变性，使得应用抗体特异性的ELISA法鉴定肉类品种的可靠性和稳定性较差。目前对于肉类品种的鉴定采用基于核酸特异性的PCR法较为广泛，但是基于PCR技术需要精密的扩增仪器，而且产物的鉴定是通过凝胶电泳来观察，不适于在现场快速检测，在基层推广难度较高。目前采用LAMP法鉴定肉类仅在生鲜肉基础上，对于经过加工处理后的肉制品用LAMP检测法测定是否含有某种待测定肉类品种未见报道。公开号为CN101591713B的中国专利《一种小鹅瘟病毒LAMP检测试剂盒》公开号为和CN101225447B的中国专利《一种新城瘟病毒LAMP检测试剂盒》分别公开了用LAMP方法检测病毒的方法，没有对肉类的检测。中国专利申请201010226683. 4《一种鉴别羊肉和鸭肉的PCR-RELP方法》，中国专利申请2007101755520.6《鸡肉、牛肉、猪肉和马肉多重PCR快速检测试剂盒及其应用》，都是基于PCR技术，需要精密的扩增仪器，而且产物的鉴定是通过凝胶电泳来观察，不适于在现场快速检测，在基层推广难度较高。
技术实现思路
本专利技术的目的就在于克服上述检测技术的缺陷，提供一种用LAMP法快速检测指定肉类品种的试剂盒，及其采用荧光染料法，能用肉眼观察显色的快速检测方法，可用于检测肉制品是否有掺假行为；还提供LAMP法检测牦牛肉、鸡肉、猪肉、兔肉、羊肉的引物。本专利技术的试剂盒技术方案是 特定肉制品的LAMP法检测试剂盒，包括五组相互独立的A型反应液，该五组相互独立的A型反应液是检测牦牛肉的反应液A-I、检测鸡肉的反应液A-2、检测猪肉的反应液A-3、检测兔肉的反应液A-4或检测羊肉的反应液A-5,还包括能与该五组相互独立A型反应液分别反应的反应液B ;各反应液的成分和配合比如下 (I)检测牦牛肉的反应液A-I :每管23. 000 μ I的组成及配合比如下，2.500 μ I 的 IOXLamp buffer> I.000 μ I 的 Bst DNA 聚合酶 8U/μ I、3.500 μ I 的 IOmM dNTP、 I. 000 μ I的20 μ M牦牛肉的内引物I : GGTAACTTGTTCCGTTGATCAAATTTTTTTAAAGACTAGACCTACAAGTCA, 1.000 μ I的20 μ M牦牛肉的内引物2 : TAGGGATAACAGCGCAATCCTTTTTATGTCCTGATCCAACATCG、 O. 125 μ I 的 20 μ M 牦牛肉的外引物 I :AAAAAATCCTCCGAACGATT、 O. 125 μ I 的 20 μ M 牦牛肉的外引物 2 :GATAGCGGTTGCACCATC、 O. 500 μ I 的 20 μ M 牦牛肉的环引物 I :GGATCAATGAGCGATAGAGTGATT、 0.500 μ I 的 20 μ M 牦牛肉的环引物 2 :TAAGAGTCCATATCGACAATAGGGT、4.000 μ I 的 25mM MgCl2、 4. 000 μ I的5Μ甜菜碱、 余量为灭菌蒸馏水； 其中，IOXLamp buffer含有200mM三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐/ pH 8.8, IOOmM氯化钾、IOOmM硫酸铵、20mM硫酸镁和1%曲拉通X-100 ； (2)检测鸡肉的反应液A-2:每管23. 000 μ I的组成及配合比如下，2.500 μ I 的 IOXLamp buffer> 1.000 μ I 的 Bst DNA 聚合酶 8U/μ I、3.500 μ I 的 IOmM dNTP、 I. 000 μ I的20 μ M鸡肉的内引物I : TGCTCGTAGTTCTCAGGCGGATTTTTCCCACTATGCCTAGCCCTA、 1.000 μ I的20 μ M鸡肉的内引物2 :AACTCTAAGGACTTGGCGGTGCTTTTGGTGGTTGGGTGAATCGTG, O. 125 μ I 的 20 μ M 鸡肉的外引物 I :AAAGCTAGGACCCAAACTGG、 O. 125 μ I 的 20 μ M 鸡肉的外引物 2 :GGTATGTAGGCTGTGCTGG、 O. 500 μ I 的 20 μ M 鸡肉的环引物 I :TGTGTGATGGGAGGTATCTAGATT、 0.500 μ I 的 20 μ M 鸡肉的环引物 2 :CCCAAACCCACCTAGAGGAG、4.000 μ I 的 25mM MgCl2、 4. 000 μ I的5Μ甜菜碱、 余量为灭菌蒸馏水； 其中，IOXLamp buffer含有200mM三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐/ pH 8.8, IOOmM氯化钾、IOOmM硫酸铵、20mM硫酸镁和1%曲拉通X-100 ； (3)检测猪肉的反应液A-3:每管23. 000 μ I的组成及配合比如下，2.500 μ I 的 IOXLamp buffer> 1.000 μ I 的 Bst DNA 聚合酶 8U/μ I、3.500 μ I 的 IOmM dNTP、 I.000 μ I的20 μ M猪肉的内引物I : CAGGCTCCTCTAGGTGGATGTTTTTCGCAACTGCCTAAAACTC、1.OOO μ I的20 μ M猪肉的内引物2 : TCGATAAACCCCGATAGACCTTTTTTTAGGGTTTGCTGAAGATGG, O. 125 μ I 的 20 μ M 猪肉的外引物 I :CAAAACTATTCGCCAGAGTAC、 O. 125 μ I 的 20 μ M 猪肉的外引物 2 ATTGTGCTTACTATTGTTCCTT, O. 500 μ I 的 20 μ M 猪肉的环引物 I :AGCACCGCCAAGTCCTTT、 0.500 μ I 的 20 μ M 猪肉的环引物 2 CCAACCCTTGCCAATTCAGCCTAT,4. 000 μ I 的 25mM MgCl2、 4. 000 μ I的5Μ甜菜碱、 余量为灭菌蒸馏水；· 其中，IOXLamp buffer含有200mM三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐/ pH 8.8, IOOmM氯化钾、IOOmM硫酸铵、20mM硫酸镁和1%曲拉通X-100 ；本文档来自技高网...

【技术保护点】
特定肉制品的LAMP法检测试剂盒，包括五组相互独立的A型反应液，该五组相互独立的A型反应液是检测牦牛肉的反应液A？1、检测鸡肉的反应液A？2、检测猪肉的反应液A？3、检测兔肉的反应液A？4或检测羊肉的反应液A？5，还包括能与该五组相互独立A型反应液分别反应的反应液B；各反应液的成分和配合比如下：（1）检测牦牛肉的反应液A？1：每管23.000？μl的组成及配合比如下，2.500？μl？的10×Lamp？buffer、1.000？μl？的Bst？？DNA聚合酶8U/μl、3.500？μl？的10mM？dNTP、？1.000？μl的20μM牦牛肉的内引物1：GGTAACTTGTTCCGTTGATCAAATT？TTTT？TAAAGACTAGACCTACAAGTCA、1.000？μl的20μM牦牛肉的内引物2：TAGGGATAACAGCGCAATCCT？TTTT？ATGTCCTGATCCAACATCG、0.125？μl的20μM牦牛肉的外引物1：AAAAAATCCTCCGAACGATT、0.125？μl的20μM牦牛肉的内引物2：GATAGCGGTTGCACCATC、0.500？μl的20μM牦牛肉的环引物1：GGATCAATGAGCGATAGAGTGATT、0.500？μl的20μM牦牛肉的环引物2：TAAGAGTCCATATCGACAATAGGGT、4.000？μl？的25mM？MgCl2？、4.000？μl？的5M甜菜碱、余量为灭菌蒸馏水；其中，10×Lamp？buffer含有200mM三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐/？pH？8.8、？100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1%曲拉通X？100；（2）检测鸡肉的反应液A？2：每管23.000？μl的组成及配合比如下，2.500？μl？的10×Lamp？buffer、1.000？μl？的Bst？？DNA聚合酶8U/μl、3.500？μl？的10mM？dNTP、？1.000？μl的20μM鸡肉的内引物1：TGCTCGTAGTTCTCAGGCGGAT？TTTT？CCCACTATGCCTAGCCCTA、1.000？μl的20μM鸡肉的内引物2：AACTCTAAGGACTTGGCGGTGC？TTTT？GGTGGTTGGGTGAATCGTG、0.125？μl的20μM鸡肉的外引物1：AAAGCTAGGACCCAAACTGG、0.125？μl的20μM鸡肉的内引物2：GGTATGTAGGCTGTGCTGG、0.500？μl的20μM鸡肉的环引物1：TGTGTGATGGGAGGTATCTAGATT、0.500？μl的20μM鸡肉的环引物2：CCCAAACCCACCTAGAGGAG、4.000？μl？的25mM？MgCl2？、4.000？μl？的5M甜菜碱、余量为灭菌蒸馏水；其中，10×Lamp？buffer含有200mM三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐/？pH？8.8、？100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1%曲拉通X？100；（3）检测猪肉的反应液A？3：每管23.000？μl的组成及配合比如下，2.500？μl？的10×Lamp？buffer、1.000？μl？的Bst？？DNA聚合酶8U/μl、3.500？μl？的10mM？dNTP、？1.000？μl的20μM猪肉的内引物1：CAGGCTCCTCTAGGTGGATG？TTTT？TCGCAACTGCCTAAAACTC、1.000？μl的20μM猪肉的内引物2：TCGATAAACCCCGATAGACCTT？TTTT？TAGGGTTTGCTGAAGATGG、0.125？μl的20μM猪肉的外引物1：CAAAACTATTCGCCAGAGTAC、0.125？μl的20μM猪肉的内引物2：ATTGTGCTTACTATTGTTCCTT、0.500？μl的20μM猪肉的环引物1：AGCACCGCCAAGTCCTTT、0.500？μl的20μM猪肉的环引物2：CCAACCCTTGCCAATTCAGCCTAT、4.000？μl？的25mM？MgCl2？、4.000？μl？的5M甜菜碱、余量为灭菌蒸馏水；其中，10×Lamp？buffer含有200mM三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐/？pH？8.8、？100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1%曲拉通X？100；（4）检测兔肉的反应液A？4：每管23.000？μl的组成及配合比如下，2.500？μl？的10×Lamp？buffer、1.000？μl？的Bst？？DNA聚合酶8U/μl、3.50...

【技术特征摘要】
1.特定肉制品的LAMP法检测试剂盒，包括五组相互独立的A型反应液，该五组相互独立的A型反应液是检测牦牛肉的反应液A-1、检测鸡肉的反应液A-2、检测猪肉的反应液A-3、检测兔肉的反应液A-4或检测羊肉的反应液A-5,还包括能与该五组相互独立A型反应液分别反应的反应液B ;各反应液的成分和配合比如下 (1)检测牦牛肉的反应液A-I:每管23. OOO μ I的组成及配合比如下，.2.500 μ I 的 IOXLamp buffer> I. 000 μ I 的 Bst DNA 聚合酶 8U/μ I、.3.500 μ I 的 IOmM dNTP、 I. 000 μ I的20 μ M牦牛肉的内引物I : GGTAACTTGTTCCGTTGATCAAATT-TTTT-TAAAGACTAGACCTACAAGTCA、 .1.000 μ I的20 μ M牦牛肉的内引物2 : TAGGGATAACAGCGCAATCCT-TTTT-ATGTCCTGATCCAACATCG、 O. 125 μ I 的 20 μ M 牦牛肉的外引物 I :AAAAAATCCTCCGAACGATT、 O. 125 μ I 的 20 μ M 牦牛肉的内引物 2 :GATAGCGGTTGCACCATC、 O. 500 μ I 的 20 μ M 牦牛肉的环引物 I :GGATCAATGAGCGATAGAGTGATT、 .0.500 μ I 的 20 μ M 牦牛肉的环引物 2 TAAGAGTCCATATCGACAATAGGGT,.4.000 μ I 的 25mM MgCl2、 .4. 000 μ I的5Μ甜菜碱、 余量为灭菌蒸馏水； 其中，IOXLamp buffer含有200mM三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐/ pH 8.8, IOOmM氯化钾、IOOmM硫酸铵、20mM硫酸镁和1%曲拉通X-100 ； (2)检测鸡肉的反应液A-2:每管23. 000 μ I的组成及配合比如下，.2.500 μ I 的 IOXLamp buffer> .1.000 μ I 的 Bst DNA 聚合酶 8U/μ I、.3.500 μ I 的 IOmM dNTP、 .1.000 μ I的20 μ M鸡肉的内引物I : TGCTCGTAGTTCTCAGGCGGAT-TTTT-CCCACTATGCCTAGCCCTA、 .1.000 μ I的20 μ M鸡肉的内引物2 : AACTCTAAGGACTTGGCGGTGC-TTTT-GGTGGTTGGGTGAATCGTG,O. 125 μ I 的 20 μ M 鸡肉的外引物 I :AAAGCTAGGACCCAAACTGG、O.125 μ I 的 20 μ M 鸡肉的内引物 2 GGTATGTAGGCTGTGCTGG,O.500 μ I 的 20 μ M 鸡肉的环引物 I :TGTGTGATGGGAGGTATCTAGATT、O.500 μ I 的 20 μ M 鸡肉的环引物 2 CCCAAACCCACCTAGAGGAG,.4.000 μ I 的 25mM MgCl2、 .4. 000 μ I的5Μ甜菜碱、 余量为灭菌蒸馏水； 其中，IOXLamp buffer含有200mM三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐/ pH 8.8, IOOmM氯化钾、IOOmM硫酸铵、20mM硫酸镁和1%曲拉通X-100 ； (3)检测猪肉的反应液A-3:每管23. 000 μ I的组成及配合比如下，·2.500 μ I 的 IOXLamp buffer> ·I.000 μ I 的 Bst DNA 聚合酶 8U/μ I、·3.500 μ I 的 IOmM dNTP、 ·I. 000 μ I的20 μ M猪肉的内引物I : CAGGCTCCTCTAGGTGGATG-TTTT-TCGCAACTGCCTAAAACTC, ·1.000 μ I的20 μ M猪肉的内引物2 : TCGATAAACCCCGATAGACCTT-TTTT-TAGGGTTTGCTGAAGATGG, ·O. 125 μ I 的 20 μ M 猪肉的外引物 I :CAAAACTATTCGCCAGAGTAC、 ·O. 125 μ I 的 20 μ M 猪肉的内引物 2 ATTGTGCTTACTATTGTTCCTT, ·O. 500 μ I 的 20 μ M 猪肉的环引物 I :AGCACCGCCAAGTCCTTT、 ·0.500 μ I 的 20 μ M 猪肉的环引物 2 CCAACCCTTGCCAATTCAGCCTAT,·4.000 μ I 的 25mM MgCl2、 ·4. 000 μ I的5Μ甜菜碱、 余量为灭菌蒸馏水； 其中，IOXLamp buffer含有200mM三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐/ pH 8.8, IOOmM氯化钾、IOOmM硫酸铵、20mM硫酸镁和1%曲拉通X-100 ； (4)检测兔肉的反应液A-4:每管23. 000 μ I的组成及配合比如下，·2.500 μ I 的 IOXLamp buffer> ·1.000 μ I 的 Bst DNA 聚合酶 8U/μ I、·3.500 μ I 的 IOmM dNTP、 ·I.000 μ I的20 μ M兔肉的内引物I : GGAAGGCTATGTCAGGAGCC-TTTT-TATAATTGGAGGCTTCGGGA、 ·1.000 μ I的20 μ M兔肉的内引物2 : CATTCCTTCTTCTACTAGCCTCCT-TTTT-GGTGGATAAACAGTTCAGC、 ·O. 125 μ I 的 20 μ M 兔肉的外引物 I :ACATGCCTTTGTAATAATCTTCT、 ·O.125 μ I 的 20 μ M 兔肉的内引物 2 :GCATGTGCAAGATTACCG、 ·O.500 μ I 的 20 μ M 兔肉的环引物 I :TGACCGAACAGGGGGACT、 ·0.500 μ I 的 20 μ M 兔肉的环引物 2 :AGTAGAAGCTGGGGCGGGGA、·4.000 μ I 的 25mM MgCl2、 ·4. 000 μ I的5Μ甜菜碱、 余量为灭菌蒸馏水； 其中，IOXLamp buffer含有200mM三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐/ pH 8.8, IOOmM氯化钾、IOOmM硫酸铵、20mM硫酸镁和1%曲拉通X-100 ； (5)检测羊肉的反应液A-5:每管23. 000 μ I的组成及配合比如下，·2.500 μ I 的 IOXLamp buffer> ·1.000 μ I 的 Bst DNA 聚合酶 8U/μ I、·3.500 μ I 的 IOmM dNTP、 ·I.000 μ I的20 μ M羊肉的内引物I :ATGTGGTTATAGCCCCTAGACATAA-TTTT-CCGGTTTTATCCACTAACAGAA、. 1.OOO μ I的20 μ M羊肉的内引物2 : TATGCGCCCTCACCCAAAAT-TTTT-TTACTATTATGAGGCCGAGTT、O.125 μ I 的 20 μ M 羊肉的外引物 I :AGCAGGCATCTTCCTACT、O.125 μ I 的 20 μ M 羊肉的内引物 2 GGGGTTGATTAATTCCGATTG,O.500 μ I 的 20 μ M 羊肉的环引物 I :GTTATTTAAACCGGTTA...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐善虎，李雪，郝小倩，
申请(专利权)人：西南民族大学，唐善虎，
类型：发明
国别省市：