浙贝母PCR鉴定试剂盒及鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种浙贝母PCR鉴定鉴定试剂盒及鉴定方法，所述试剂盒中的特异性引物为ZB1和ZB2，ZB1：5'-ACAGTACTGGGGGAGAAGTC-3'，ZB2：5'-CAAATGGAGGGTATGTGTCG-3'；本发明专利技术根据凝胶电泳在719bp处有无扩增条带作为鉴定浙贝母的依据，可以检测单个或者混合贝母DNA样品，本发明专利技术提供了一种快速、准确鉴定浙贝母的方法，可以广泛应用于浙贝母中药选种育种、种植、采收储存、销售、临床应用各环节的品种鉴定，在鉴别中药真伪，打击伪品，加强中药质量监管，促进中药现代化发展方面具有重大意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种中药材浙贝母的DNA分子鉴定方法，特别涉及中药浙贝母PCR鉴定试剂盒、特异性引物、模板及鉴定方法。
技术介绍
浙贝母是一种常用中药，具有止咳化痰的疗效，是道地药材“浙八味”之一。除了浙贝母外，药典记载的贝母品种包括川贝、湖北贝母、平贝母和伊贝母，另外流通领域还存在浙贝母的伪品草贝母和土贝母。贝母因为品种的不同，药效差别较大，伪品具有毒性，而且各品种之间价格差异非常大，对浙贝母进行鉴定具有重要意义。浙贝母与其他品种外观 非常相似，利用常规的中药鉴定方法很难将它们进行区分鉴别。当药材加工成粉末后就更加难以鉴定。利用DNA分子鉴定方法能够解决浙贝母鉴别困难的问题，因为这种方法能够从基因水平上进行品种的甄别，具有准确、高效、重复性好，不受样品产地、生长环境和来源的影响。本专利技术提供的PCR检测法就是一种浙贝母的DNA分子鉴定方法，能够准确鉴定浙贝母。目前此种方法在浙贝母鉴定中的应用在专利号03113004. 6公开说明书中有所描述，但是使用的引物序列是利用GeneBank数据库下载的贝母植物RNA分子的序列随机设计的。本专利技术提供的引物是根据浙贝母基因组中的特异性DNA分子标记的序列设计的，所获引物的获取途径和序列与专利号03113004. 6公开说明书中所述完全不同。由于本专利技术提供的引物序列是建立于浙贝母区别于其他品种的特异性DNA分子标记的筛选、克隆和测序工作上的成果，因此，应用该引物的PCR检测法准确性和灵敏度更高，能用于检测混合DNA样品。并且，本专利技术提供的PCR检测法在检测步骤和检测结果判断依据上也与专利号03113004. 6公开说明书中的所述内容不同。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种能够准确鉴定中药浙贝母的PCR鉴定试剂盒及检测法，包括PCR检测法关键试剂PCR引物、模板和PCR检测法的检测步骤。本专利技术采用的技术方案是本专利技术提供一种浙贝母PCR鉴定试剂盒，所述试剂盒中的特异性引物为ZBl和ZB2 ZBl : 5’-ACAGTACTGGGGGAGAAGTC-3’，ZB2 :5’-CAAATGGAGGGTATGTGTCG-3’ 。进一步，所述浙贝母PCR鉴定试剂盒的组成为IOxPCRbpffer2μ MgCl2(25 inM)l.2.uL dNl-Ps(iOmM)O.SpLTaq DNA polymeraseI 2 单位引物 ZBl (20μΜ)0.5pL引物 ΖΒ2 (20μΜ)0.5pLo 本专利技术还涉及一种适于本专利技术浙贝母PCR鉴定试剂盒的浙贝母基因，所述浙贝母基因的核苷酸序列为SEQ ID NO. I所示。SEQ ID NO. I 序列5，- .(cgacgaagaaI cggacagtactgggggagaagtcaaatactgttttatctgcctgaaggctGCTTCGCACTCTTCCGTCCATTCAAACTCTCTGCTTCCTCATAGCATCGCTGTAAAAGTTTTTATCTTGTCCGATGATCTTGATATGAAGCGGTAAAGGGCTGCTATTCTTCCACTCAGTACCTGTATGTCTTTCACTGTTTTGGGGCTTTCCATCCCCAGTATCGATTTTGTTTGCGCTGGATCTGCGCTGATTCTCTTCTTGTGCACTATGTGCCCTAAGAACTTACCTAAAGCTACTCCAAATATGCATTTTTTTGGATTCAATTTCAGGGAGAAGATGCGTAATCGGTCGAAGGCCTCCTCTAGGTTCTGGATATGATCCTCCTTTTTAGAACTTTTTACCAGTAAATCATCAATTTATGTGCCTACTGTTTTCCCTAGTAGCCCTTGAAAGATTCTGGTAATCAACCGTTGAAAAGTTGCTCCTGCATTCTTAAGTCCAAAGGGCATCACCGTGTAGCAATATAACCCTAAGGGAGTAGTGAAACTGGTGTGTTCCTCATCTTGCAGATTTAACTTGATTTGATTATAGCCTGAACAGGCATCCAAAAAAGATATCCTCTCGTGACCCACCAGTGAGTCCACCAACTGGCATATCCGTGGTAGCGGGAAACTGTCCTTGGGACAGGCTTTATTTAGATCTGTGTAGTCGACACATACCCTCCATTTGCCG " ΤΓΤΤ(、( Γ「Γ( ;| -3，框内序列为RAPD引物序列。本专利技术所述核苷酸序列为SEQ ID NO. I所示的基因是根据常规提取法(CTAB法)从浙贝母、川贝母、湖北贝母、平贝母、伊贝母中提取基因组DNA。使用RAH)扩增法对五种贝母进行RAH)分析，筛选获得一条浙贝母特异性扩增条带，这条扩增条带只出现在浙贝母品种中，在其他贝母品种中没有，此条带中的DNA分子即是浙贝母特异性DNA分子标记。将浙贝母特异性DNA分子标记从胶中回收，克隆，测序后获得。本专利技术涉及一种利用所述浙贝母PCR鉴定试剂盒对浙贝母进行鉴定的方法，所述方法为(I)模板DNA的提取和质量鉴定采用常规提取法提取供试品DNA作为PCR的模板；以电泳法检测模板DNA的质量(检测方法同步骤(3))，条带清晰无弥散的，即为符合PCR反应的模板DNA ；(2)PCR鉴定利用浙贝母PCR鉴定试剂盒中的特异性引物ZBl和ZB2进行PCR扩增PCR反应溶液I OxPCRbpffer2^L Mg€l2(25 mM)1.2pL dNTPs(lOmM)0.5μ Taq DNA polymeraseI 2 单位引物 ZBl (20μΜ)0.5pL 引物 ΖΒ2 (20μΜ)0.5pL模板DNAI 2μ (IdH2Oft]至 20μ 将PCR反应溶液放入PCR自动扩增仪器中进行PCR扩增反应，反应程序设置为95°C预变性5min，95°C变性30s，52 60°C复性30s，72。。延伸2min,30个循环，最后72°C延伸5min ；(3) PCR产物进行电泳检测取出PCR扩增产物(即扩增反应后的反应液)5 μ L与加样缓冲液I μ L混合，用I. 5%琼脂糖凝胶电泳(含O. 5%溴化乙锭)检测扩增结果，在719bp处出现扩增条带的为浙贝母，在719bp处不出现扩增条带的不是浙贝母。与现有技术相比，本专利技术的有益效果主要体现在(1)本专利技术根据凝胶电泳在719bp处有无扩增条带作为鉴定浙贝母的依据，可以检测单个或者混合贝母DNA样品，检测准确、灵敏度高、操作简单、耗时短、重复性好；(2)利用浙贝母PCR鉴定试剂盒中引物ZBl和ZB2以及PCR反应溶液配方可以制造浙贝母鉴定试剂盒；(3)本专利技术提供了一种快速、准确鉴定浙贝母的方法，可以广泛应用于浙贝母中药选种育种、种植、采收储存、销售、临床应用各环节的品种鉴定，在鉴别中药真伪，打击伪品，加强中药质量监管，促进中药现代化发展方面具有重大意义。附图说明图I十三种供试品经PCR检测法鉴定后的电泳图，泳道f 13分别为为蒜、葱、黄精、玉竹、郁金香、百合、湖北贝母、川贝母、平贝母、伊贝母、土贝母、草贝母、浙贝母，泳道M为 markerο图2为不同浓度的浙贝母经PCR检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种浙贝母PCR鉴定试剂盒，其特征在于所述试剂盒中的特异性引物为ZB1和ZB2：ZB1：5“？ACAGTACTGGGGGAGAAGTC？3“，ZB2：5“？CAAATGGAGGGTATGTGTCG？3“。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李敏，赵欣，黄龙妹，陈剑，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：