检测无乳链球菌抗体的乳胶凝集试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测奶牛无乳链球菌抗体的乳胶凝集试剂盒，制备试剂盒的方法及其应用。该试剂盒由乳胶凝集颗粒，阳性对照血清，阴性对照血清，样品稀释液，载玻片和刻度吸管组成；采用该试剂盒检测奶牛是否患乳房炎，方法简便快速，特异性强，灵敏度高，不需要仪器设备，适合于基层兽医检测。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种检测奶牛无乳链球菌抗体的乳胶凝集试剂盒，制备试剂盒的方法及其应用。该试剂盒由乳胶凝集颗粒，阳性对照血清，阴性对照血清，样品稀释液，载玻片和刻度吸管组成；采用该试剂盒检测奶牛是否患乳房炎，方法简便快速，特异性强，灵敏度高，不需要仪器设备，适合于基层兽医检测。【专利说明】检测无乳链球菌抗体的乳胶凝集试剂盒及应用
本专利技术涉及动物疫病检测
，具体地说，本专利技术涉及一种检测奶牛无乳链球菌抗体的试剂盒及试剂盒在无乳链球菌抗体检测中的应用。技术背景长期以来，奶牛乳房炎一直是影响奶牛养殖业发展与奶制品食品安全的头号疾病，此病易得、易复发、难治、难根除。我国现有奶牛群中，临床乳房炎发病率达9.7%?55.6%，隐性乳房炎阳性率达到61.03%?79.62% (冯万宇等，生物制剂在奶牛乳房炎防治中的应用，畜牧兽医杂志，2010,4:31-33)。引起奶牛乳房炎的病原菌中，无乳链球菌所占比例较大。国内学者的调查结果显示，我国因无乳链球菌引起的奶牛乳房炎约占总发病率的20%?40%(李宏胜等，奶牛乳房炎病原菌区系分布及发病规律研究，动物医学进展，2005，26(6):146-149)。因此，控制无乳链球菌的传播和感染是奶牛乳房炎防控的重要内容之一。无乳链球菌为革兰氏阳性球菌，无荚膜，无鞭毛，直径0.5?1.0 μ m，是引起牛和羊的急性、慢性乳房炎的最常见病原菌(陆承平，兽医微生物学(第三版)，北京:中国农业出版社，2001:208?209)。为了预防和控制奶牛乳房炎，国内多家单位相继开发了含有无乳链球菌成分的奶牛乳房炎疫苗(李宏胜等，奶牛乳房炎多联疫苗的研制及应用，中国农学通报(2005年专刊):151?156 ;杨定兴等，奶牛链球菌乳房炎灭活疫苗及其制备方法:中国，CN201010547036, 2010-12-28.)，为奶牛乳房炎的防控提供了有效的武器。虽然国内已有奶牛乳房炎疫苗，但是对于疫苗免疫效果的评价，特别是免疫后抗体水平监测，尚缺乏简便快速的检测技术。这导致免疫是否合格、是否需要加强免疫等情况无法快速查明，给奶牛乳房炎的防控带来了不便。目前，已有针对奶牛无乳链球菌的病原学检测技术，如生化鉴定、PCR和乳胶法(胡瑞萍等，无乳链球菌检测及其奶牛乳腺炎防治的研究进展，中国兽药杂志，2008，42 (6):54-57)，但对于该菌的抗体检测方法，则只报道有ELISA检测方法(张捷等，间接ELISA检测奶牛乳房炎疫苗保护效果方法的建立，中国奶牛，2009，11:38-41 ;郎景民等，牛源无乳链球菌sip蛋白抗原优势区的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立，中国预防兽医学报，2011,33 (1):37-40)。ELISA方法检测抗体耗时较长，仅检测过程就花费2小时以上，且需要借助酶标仪等设备，因此该方法在临床使用上受到一定限制。乳胶凝集法由于迅速、简单和无须专门的技能和仪器设备而具有巨大的优势，适合基层推广。研究表明无乳链球菌表面有许多保守性蛋白，具有良好的免疫原性(沈定树等，无乳链球菌表面蛋白的研究进展，中国微生态学杂志，2007，19 (5):472?473)。目前建立的奶牛无乳链球菌抗体检测方法均以菌体总蛋白或大肠杆菌表达的蛋白作为抗原。菌体总蛋白成分复杂，针对性不强，容易导致建立的检测方法特异性下降；从大肠杆菌中纯化表达的抗原成本高，且抗原活性难以保证。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测奶牛无乳链球菌抗体的乳胶凝集试剂盒，该试剂盒能在不借助任何仪器设备的情况下快速检测奶牛血清中的无乳链球菌抗体，简单实用。本专利技术的另一个目的是无乳链球菌抗体的乳胶凝集试剂盒在检测奶牛无乳链球菌抗体中的应用以及乳胶凝集试剂盒在奶牛乳房炎疫苗免疫抗体检测中的应用。本专利技术的另一个目的是提供无乳链球菌抗体的乳胶凝集试剂盒检测奶牛乳房炎的方法。本专利技术的另一个目的是提供无乳链球菌CVCC1886菌株在检测奶牛乳房炎中的应用。本专利技术公开了一种检测奶牛无乳链球菌抗体的乳胶凝集试剂盒，该试剂盒包括a)乳胶凝集颗粒，b)阳性对照血清，c)阴性对照血清，d)样品稀释液，e)载玻片和刻度吸管，其特征在于:a)乳胶凝集颗粒为无乳链球菌表面抗原致敏的聚苯乙烯颗粒，b)阳性对照血清是无乳链球菌表面抗原免疫的奶牛产血清，c)阴性对照血清是未免疫的奶牛产血清；其中的无乳链球菌是cvccl886菌株。本专利技术公开了无乳链球菌表面抗原的制备方法，无乳链球菌表面抗原通过下列步骤制备:(I)将无乳链球菌CVCC1886株接种于含5%胎牛血清的TSB培养基中，37°C恒温振荡培养；(2)离心收集菌体，用由IOmM Tris, ImM EDTA, pH值8.0组成的TE缓冲液重悬；(3)超声波破碎，5000转/分离心15min，上清液再超速离心，收集沉淀，用含1.5%triton-X100的TE缓冲液重悬，室温放置30min使之溶解；(4)加入等体积的饱和硫酸铵溶液，40C下沉淀2小时；(5)离心收集蛋白质沉淀，用TE缓冲液重悬，装入透析袋中透析3天，其间更换透析液3次；(6)收集透析后的蛋白溶液,测定无乳链球菌表面抗原浓度，并浓缩到2mg/mL蛋白浓度，得无乳链球菌表面抗原。本专利技术还公开了无乳链球菌表面抗原致敏的聚苯乙烯颗粒制备方法，无乳链球菌表面抗原致敏的聚苯乙烯颗粒通过下列步骤制备:(I)无乳链球菌表面蛋白用BBS稀释至蛋白含量为600 μ g/mL，逐滴加入到等体积预处理的2%空白胶乳中，边滴加边摇动，使其充分混匀；(2)置于25°C恒温箱中静置3小时；(3)逐滴加入10%牛血清蛋白(BSA)至终浓度为1%，充分混合均匀后，再置于37°C恒温箱中静置30min ；(4) 6000转/分离心15min，弃上清，沉淀用BBS重悬得无乳链球菌表面抗原致敏的聚苯乙烯颗粒。本专利技术公开了无乳链球菌抗体的乳胶凝集试剂盒在检测奶牛无乳链球菌抗体中的应用。本专利技术公开了无乳链球菌抗体的乳胶凝集试剂盒检测奶牛乳房炎的方法，该方法包括下列步骤:(I)采集奶牛静脉血液，室温放I小时，分离血清；(2)滴加10微升待检血清样品，加入等体积的乳胶凝集试剂，用牙签搅拌均匀，摇动30秒后观察结果，同时设置阳性血清和阴性血清作为对照；(3)出现50%及以上的乳胶凝集现象时，即判为阳性结果，否则判为阴性。本专利技术公开了无乳链球菌cvccl886菌株在检测奶牛乳房炎中的应用。本专利技术中的无乳链球菌标准株CVCC1886株登载于中国国家兽医微生物菌种保藏中心的目录中，处于公开状态，科学工作者可向该菌种保藏中心索取。 本专利技术中，乳胶凝集试剂也叫乳胶凝集颗粒。本专利技术公开的试剂盒中的乳胶凝集试剂，按下列步骤制备:A、提取无乳链球菌表面蛋白抗原，方法如下:(I)将无乳链球菌标准株(CVCC1886株，购自国家兽医微生物菌种保藏中心接种于含5%胎牛血清的TSB培养基中，37°C恒温振荡培养约6小时。(2)离心收集菌体，用TE缓冲液(IOmM Tris7ImM EDTA，pH值8.0)重悬。(3)超声波破碎，5000转/分离心15min，收集上清液。(4)超速离心，收集沉淀，用含1.5%triton-X100的TE缓冲液重悬，室温放置30min使之溶解。(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测奶牛无乳链球菌抗体的乳胶凝集试剂盒，该试剂盒包括a)?乳胶凝集颗粒，b)阳性对照血清，c)阴性对照血清，d)样品稀释液，e)载玻片和刻度吸管，其特征在于：a)乳胶凝集颗粒为无乳链球菌表面抗原致敏的聚苯乙烯颗粒，b)阳性对照血清是无乳链球菌表面抗原免疫的奶牛产血清，c)阴性对照血清是未免疫的奶牛产血清，其中无乳链球菌是cvcc1886菌株。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：卢顺，高其双，向敏，黄海军，陈志华，占才耀，彭霞，周莉，钱运国，童伟文，陶弼菲，夏瑜，王莲芳，华娟，
申请(专利权)人：武汉市畜牧兽医科学研究所，
类型：发明
国别省市：