【技术实现步骤摘要】
—种筛选大肠杆菌生物膜毒力基因的方法
本专利技术属于基因筛选领域，尤其涉及。
技术介绍
大肠杆菌是人和动物肠道中最著名的一种迦直，主要寄生于大肠内，约占肠道菌中的1%。是一种两端钝圆、能运动、无芽孢的革兰氏阴性短杆菌。大肠杆菌能合成维生素B和K，正常栖居条件下不致病；若进入胆囊、膀胱等处可引起炎症。在水和食品中检出，可认为是被粪便污染的指标。大肠菌群数常作为饮水、食物或药物的卫生学标准。大肠杆菌0157:H7血清型属肠出血性大肠杆菌，自1982年在美国首先发现以来，包括中国等许多国家都有报道，且日见增加。日本近年来因食物污染该菌导致的数起大暴发，格外引人注目。在美国和加拿大通常分离的肠道致病菌中，目前它已排在第二或第三位。大肠杆菌0157:H7引起肠出血性腹泻，约2%~7%的病人会发展成溶血性尿毒综合征，儿童与老人最容易出现后一种情况。致病性大肠杆菌通过污染饮水、食品、娱乐水体引起疾病暴发流行，病情严重者，可危及生命。大肠杆菌(Escherichia coli, E.coli)革兰氏阴性短杆菌，大小0.5X I~3微米。周身鞭丢，能运动，无芽抱。能发酵多种...
【技术保护点】
一种筛选大肠杆菌生物膜毒力基因的方法,其特征在于，该方法包括以下步骤：步骤一、准备筛选大肠杆菌生物膜毒力基因的材料；步骤二、生物膜?96孔板微量法测定大肠杆菌生物膜；步骤三、筛选大肠杆菌生物膜毒力基因；步骤四、记录大肠杆菌形成生物膜检测?96孔微量板法的结果、目的基因fimH、KpsMTII、chuA、fliCPCR扩增结果、毒力基因筛选结果；步骤五、统计检测大肠杆菌生物膜毒力基因的分布。
【技术特征摘要】
1.一种筛选大肠杆菌生物膜毒力基因的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: 步骤一、准备筛选大肠杆菌生物膜毒力基因的材料； 步骤二、生物膜-96孔板微量法测定大肠杆菌生物膜； 步骤三、筛选大肠杆菌生物膜毒力基因； 步骤四、记录大肠杆菌形成生物膜检测-96孔微量板法的结果、目的基因fimH、KpsMTI1、chuA、fliCPCR扩增结果、毒力基因筛选结果； 步骤五、统计检测大肠杆菌生物膜毒力基因的分布。2.如权利要求1所述的筛选大肠杆菌生物膜毒力基因的方法，其特征在于，筛选大肠杆菌生物膜毒力基因的材料包括病料、培养基、试剂药品、仪器； 病料为25株生物膜鉴定阳性大肠杆菌甘油菌；培养基为LB培养基、M9培养基、麦康凯培养基；试剂药品为 10 X tagplusBuffer、dNTPMisture、DL2000marker、6 X loadingBuffe、核酸染料EBl X TAE,胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、琼脂糖、U型96孔板、结晶紫、1%PBS缓冲溶液、33%冰醋酸溶液；仪器为紫外线可见分光光度计C0DES54、全波长酶标仪PowerffaveXS> THZ-82A气浴恒温振荡器、小型离心机。3.如权利要求1所述的筛选大肠杆菌生物膜毒力基因的方法，其特征在于，生物膜-96孔板微量法测定大肠杆菌生物膜的具体方法为: (1)从_70°C冰箱中取出甘油保存菌株，待菌液在冰浴下溶解后，取IOOuL菌液接种于5mLLB液体培养基中，于37°C过夜震荡培养； (2)将菌液接种于麦康凯培养基中，置于37°C恒温培养箱内培养24h； (3)麦凯培养基中挑取红色单菌落，接种到新鲜的LB液体培养基，37°C恒温振荡培养16h ； (4)按1:100倍稀释:取培养的菌液50uL于新鲜的5mLLB试管液体培养基上，于37°C缓慢震摇4.5h，保证细菌处于对数生长期； (5)将紫外可见分光光度计预热半小时； (6)取2mL菌液于干净比色皿中，同时取2mLLB液体培养基作为空白对照； (7)调整波长为600nm，初始波长为200nm； (8)测菌液OD6tltlnm值，记录数据； (9)用灭菌的M9液体培养基将所测OD6tltol值稀释至0.01 ; (10)取200uL稀释至0.01菌液加入96孔U型平底板中，每个菌液加6孔，用M9液体培养基作为空白对照，于37°C恒温箱中培养36h ； (11)将培养好的96孔U型平底板从恒温箱中取出，弃菌液； (12)用1%PBS缓冲液洗96孔U型平底板，重复三次，弃洗液，拍干； (13)将甲醇加入96孔U型平底板中，固定15min,倒出并晾干； (14)将1%结晶紫溶液加入96孔U型平底板中，染色5min，自来水冲洗，晾干后观察并记录结果； (15)将33%的冰醋酸加于96孔U型平底板中，待细菌生物膜完全溶解后，用全波长酶标仪中测定OD6ticinm。4.如权利要求1所述的筛选大肠杆菌生物膜毒力基因的方法，其特征在于，生物膜阳性OD6tltlnm值判定标准如下:将阴性对照平均OD值加上其3倍的标准差SD定义为临界...
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