细菌聚集表面的处理制造技术

本发明专利技术提供了通过与具有Ｎ－酰基高丝氨酸内酯降解活性的物质接触来处理聚集了能产生生物薄膜的细菌的表面，其中所述的具有Ｎ－酰基高丝氨酸内酯降解活性的物质获自丽蝇、丝光绿蝇（Ｌｕｃｉｌｉａｓｅｒｉｃａｔａ）幼虫的分泌物和／或排泄物。此外，当所述的幼虫分泌物／排泄物与抗生素，例如四环素结合使用时可获得协同作用。这些获自丝光绿蝇幼虫分泌物和／或排泄物的具有Ｎ－酰基高丝氨酸内酯降解活性的物质也构成了本发明专利技术的一部分。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种利用丝光绿蝇的幼虫的分泌物处理聚集了能产生生物薄膜的细菌的表面的方法以及可用于此方法的组合物。生物薄膜是在表面生长并且持续存在的生物膜。它们可存在于运输或处理流体的工业设备的表面上、管道系统中以及在与这些设备或系统邻近的表面上。它们通常存在于医用植入物或插入到体内的装置的表面上。它们也可形成于暴露于空气的身体的区域；尤其是它们可存在于伤口中以及在肺的内层上。生物薄膜可被描述成包围在粘附于表面的多糖基质内的细菌群落。生物薄膜通常为稳定的形式，通过传统方法很难对其进行处理。这取决于其中包埋了微生物的多糖生物薄膜基质的保护特性。常规的药物，诸如抗生素受生物薄膜中微生物的扩散壁垒或改变的新陈代谢状态的影响而效果较小。生物薄膜的形成被认为与微生物通过被称为密度感受的过程进行的可扩散的信号分子的产生相关。这些分子被认为通过微生物启动外多糖、外蛋白质及其它次级代谢产物的产生。干扰这些分子作用的化合物可抑制生物薄膜的形成和/或削弱已经形成的生物薄膜。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种最普通和最成问题的传染性细菌。尤其是其形成的生物薄膜很难用常规的抗生素处理。铜绿假单胞菌形成的生物薄膜对于具有囊状纤维化的患者是非常严重的问题，其中铜绿假单胞菌在所述患者的肺中繁殖会引起很难治疗且最终常常致死的感染。有效的伤口愈合是一个复杂的生理过程，其涉及许多的机制包括细胞迁移、生长因子的分泌、血管生成、组织n lelling以及有助于以协调以及以明显分阶段的方式来促进受控的组织再生的伤口的固有蛋白酶/抗蛋白酶平衡。伤口护理产品在现代医疗实践中是必要的，尤其是用于慢性创伤或烧伤患者的治疗。许多不同的物质以前被认为具有有助于伤口愈合的活性。这些以前所讨论的物质包括链激酶、胶原酶以及链道酶(全部获自细菌来源)、菠罗蛋白酶(来自菠萝)、纤溶酶和胰蛋白酶(获自牛)以及磷虾酶(获自甲壳纲动物)。临床试验的数据显示这些物质仅对促进伤口愈合部分地有效。已知作为活生物体的丽蝇(green bottle fly)、丝光绿蝇的幼虫(蛆)具有显著的伤口愈合特性。利用丝光绿蝇幼虫进行的清创术治疗已成为被广泛接受的临床应用。然而，在文献中很少有关于此方式的报道，其中这些幼虫能够将伤口净化到通常非妥协性的伤口愈合的程度。愈合可以是机械的、生化的或两者相结合的方式。我们的工作表明了可以利用体外分泌物来模仿这些幼虫的作用。尽管是有效的，然而活幼虫对许多来说是使人厌恶的，并且通过在伤口上利用活幼虫以及当使用幼虫时不可避免地将它们的天然分泌物导入到伤口中，对于许多病人和对许多医疗工作者来说是无法接受的。使用活的生物体也增加了患者发生过敏性反应的危险。已知丝光绿蝇幼虫的排泄物/分泌物(ES)含有一种显示出胰蛋白酶类丝氨酸蛋白酶活性的酶。本专利技术是基于发现了体外的ES也具有破坏细菌产生的低分子量信号分子的能力来测定细菌群落的密度，并且因此破坏生物薄膜所赖以形成的细菌信息网络。本专利技术的第一个方面提供了一种处理聚集了能产生生物薄膜的细菌的表面的方法，其包括用获自丝光绿蝇分泌物/排泄物的具有N-酰基高丝氨酸内酯降解活性的物质接触表面。典型地，所述的能产生生物薄膜的细菌为铜绿假单胞菌或金黄色葡萄球菌。目前通常比较接受的对生物薄膜的研究是更接近于细菌存在的自然模式而不是更广泛地研究浮游生物的系统。Thomas S.等，J.TissueViability，1999 Vol 9 No.4 p127-132报道了丝光绿蝇幼虫的分泌物针对浮游细菌细胞的抗微生物活性。我们尚不能重复这些结果。然而，在我们的实验中，我们已经发现在实验室的条件下，丝光绿蝇幼虫的分泌物具有阻止或减少细菌性的生物薄膜形成的活性。去除伤口中的细菌性的生物薄膜在与感染进行的斗争中将是有利的。我们的实验显示作为细菌性的生物薄膜的一部分而形成的外多糖被通过丝光绿蝇分泌物的作用去除。这些作用有说服力地表明了在分泌物中存在糖苷酶活性。慢性伤口的愈合已被证明由于细菌感染的存在而削弱。感染的水平影响愈合和恶化之间的平衡。导致伤口组织缺氧和病变作用的细菌是有效愈合的阻碍。众所周知，可扩散的低分子量的信号分子允许单独的细菌来测定群体密度，并且因此当集聚“密度”时以一种协调的方式进行作用。这些作用，通常被称为“密度感受”，现在已知它调控病原体中毒性决定因子的产生，因此确保感染危险期的巩固的攻击。已知低分子量的信号分子(密度感受分子)包括N-酰基高丝氨酸内酯，例如，来自铜绿假单胞菌(参见附图说明图1)的N-丁酰基L-高丝氨酸内酯(BHL)和N-(3-氧代十二烷基)-L-高丝氨酸内酯(OdDHL)。内酯也引起真核生物组织中的细胞程序性死亡，因此在抵抗伤口愈合所需的组织再生中起作用。显然破坏这些信号分子将减少细菌对宿主组织的有效攻击的能力。我们通过实验表明，丝光绿蝇幼虫的分泌物具有降解BHL和较小程度的降解OdDHL的活性。一旦细菌形成一种生物薄膜，BHL被认为是更有活性的。我们已发现这些活性为热稳定的，然而对苯基甲磺酰氟(PMSF)和4-氨基苯基-甲磺酰氟(APMSF)是敏感的，已知其中所述的苯基甲磺酰氟(PMSF)和4-氨基苯基-甲磺酰氟(APMSF)抑制丝氨酸蛋白酶和酯酶的活性。来自丝光绿蝇幼虫的分泌物可以通过用磷酸盐缓冲液洗涤无菌的幼虫，然后在无菌的条件下过滤来收集。我们令人惊讶地发现，当幼虫的分泌物与常规的抗生素诸如四环素结合使用时，具有大于幼虫分泌物和抗生素分别单独地使用时各自的作用。因此，当组合使用时这些单独的物质之间具有某些协同作用。因此，根据进一步的方面，本专利技术提供了包括丝光绿蝇幼虫的分泌物和一种或多种抗生素化合物的抗微生物组合物。在一个优选的实施方案中，所述的抗生素化合物为四环素。在我们研究的过程中，我们意识到幼虫分泌物的很多重要组分可能被忽略了，如它们可以是在血淋巴或其它组织中通过暴露于细菌就可诱导的(如Hoffmann等在Drosophila melanogaster中描述的(1999))而不是组成型表达的。因此，我们测试了在体外暴露于用于在血淋巴中产生抗微生物化合物的细菌之后表型改变的丝光绿蝇幼虫。可利用任意已知的皮肤传递系统或输入到无菌载体诸如膏药中以敷料的形式将添加或者没有添加常规抗生素的无菌分泌物输送到伤口区域上，来用于伤口区域。实验用于制备丝光绿蝇(L.sericata)分泌物的方法1日龄的(1St龄虫)叉叶绿蝇丝光绿蝇的幼虫购自SurgicalMaterials Testing Laboratory(SMTL)Bridgend。在无菌条件下饲养且利用无菌设备以及在层流橱柜中收集所有这些丝光绿蝇幼虫的分泌物。在向每一通用样品(含有大约200个幼虫)中添加200μl磷酸的缓冲盐水溶液(PBS)后，收集分泌物。在移取(无菌移液管)、离心(13,000xg 10分钟)和冷冻(-20℃)分泌物之前用PBS洗涤幼虫。在第二次洗涤之前，让幼虫休息40分钟，然后重复进行第三次洗涤。测定所收集的分泌物的蛋白质含量(BioRad蛋白测定试验)和蛋白酶活性(异硫氰胺荧光素标记的(FITC)酪蛋白)。无菌过滤分泌物(22μm过滤)并等分备用且在-20℃储藏。1.丝光绿蝇本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种处理聚集了能产生生物薄膜的细菌的表面的方法，其包括使获自丝光绿蝇分泌物／排泄物的具有Ｎ－酰基高丝氨酸内酯降解活性的物质与表面接触。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：DI普里查德，
申请(专利权)人：英国国防部，
类型：发明
国别省市：GB[英国]