本发明专利技术公开了突变型Δ-5去饱和酶，其能够将二高-γ-亚麻酸[DGLA；20:3ω-6]转化成花生四烯酸[ARA；20:4ω-6]和/或将二十碳四烯酸[ETA；20:4ω-3]转化成二十碳五烯酸[EPA；20:5ω-3]，并且在细胞色素b5-样域的HPGG（SEQ?ID?NO:7）基序内具有至少一个突变，以及在HDASH（SEQ?ID?NO:8）基序内具有至少一个突变。还公开了分离的核酸片段和包含此类编码Δ-5去饱和酶的片段的重组构建体，以及制备长链多不饱和脂肪酸[“PUFA”]的方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】突变型HPGG基序和HDASH基序Δ-5去饱和酶以及它们在制备多不饱和脂肪酸中的用途本专利申请要求2010年8月26日提交的美国临时申请61/377248和2010年12月30日提交的美国临时申请61/428277的权益，上述专利申请的公开内容据此全文以引用方式并入。
本专利技术属于生物
更具体地，本专利技术涉及制备编码突变型Δ-5脂肪酸去饱和酶（其中在细胞色素b5-样域的HPGG[SEQIDNO:7]基序内发生至少一个突变，并且在HDASH[SEQIDNO:8]基序内发生至少一个突变）的核酸片段。
技术介绍
包括植物、藻类、真菌、原生藻菌（stramenopiles）和酵母在内的多种不同宿主正被研究旨在用于商业化多不饱和脂肪酸[“PUFA”]生产。基因工程已展示出，一些宿主（即使是亚油酸[LA；18:2ω-6]和α-亚麻酸[ALA；18:3ω-3]脂肪酸生产天然受限的那些）的天然能力可被充分改变以致使高水平生产多种长链ω-3/ω-6PUFA。花生四烯酸[ARA；20:4ω-6]、二十碳五烯酸[EPA；20:5ω-3]和二十二碳六烯酸[DHA；22:6ω-3]的生产可能都需要Δ-5去饱和酶基因的表达，无论这是天然能力还是重组技术的结果。因此，本专利技术涉及具有高活性的新型Δ-5去饱和酶，其很好地适于整合进商用宿主细胞中的PUFA生物合成途径中。
技术实现思路
在第一实施方案中，本专利技术涉及具有Δ-5去饱和酶活性的突变多肽，其包含：(a)如SEQIDNO:34[HxGx]所示的氨基酸基序，其中SEQIDNO:34[HxGx]与SEQIDNO:7[HPGG]不同；和(b)如SEQIDNO:1[HxxxH]所示的氨基酸基序，其中SEQIDNO:1[HxxxH]与SEQIDNO:8[HDASH]不同。在第二实施方案中，(a)的氨基酸基序选自：SEQIDNO:9[HgGG]、SEQIDNO:10[HhGG]、SEQIDNO:11[HPGs]、SEQIDNO:12[HcGG]、SEQIDNO:13[HwGG]和SEQIDNO:14[HaGG]；并且，(b)的氨基酸基序选自：SEQIDNO:15[HDgSH]、SEQIDNO:16[HDsSH]、SEQIDNO:17[HDAaH]、SEQIDNO:18[HDAgH]和SEQIDNO:19[HeASH]。在第三实施方案中，基于BLASTP比对方法在与具有选自：SEQIDNO:21、SEQIDNO:25和SEQIDNO:29的序列的多肽进行比较时，所述突变多肽具有至少90%的序列同一性。在第四实施方案中，所述突变多肽的氨基酸序列选自：SEQIDNO:139[EgD5R*-34g157g]、SEQIDNO:141[EgD5R*-34g158a]、SEQIDNO:143[EgD5R*-34g158g]、SEQIDNO:145[EgD5R*-34h158a]、SEQIDNO:147[EgD5R*-34h158g]、SEQIDNO:149[EgD5R*-36s158a]、SEQIDNO:151[EgD5R*-36s158g]、SEQIDNO:153[EgD5M、密码子优化的EgD5R*-34g158g]、SEQIDNO:157[EgD5M1、密码子优化的EgD5R*-34g158g347s]、SEQIDNO:181[EgD5S-36s156e]、SEQIDNO:183[EgD5S-36s157g]、SEQIDNO:185[EgD5S-36s158a]、SEQIDNO:187[EgD5S-36s158g]、SEQIDNO:213[EaD5S-35a158g]、SEQIDNO:215[EaD5S-35a158s]、SEQIDNO:217[EaD5S-35a159g]、SEQIDNO:255[EgD5R-34g158g]、SEQIDNO:260[EgD5R-34g158a]、SEQIDNO:271[EaD5-35g159g]和SEQIDNO:276[EaD5-35g159a]。在第五实施方案中，所述突变多肽的二高-γ-亚麻酸至花生四烯酸的转化效率为亲本多肽的二高-γ-亚麻酸至花生四烯酸的转化效率的至少64%，所述亲本多肽包含与SEQIDNO:7[HPGG]相同的氨基酸基序和与SEQIDNO:8[HDASH]相同的氨基酸基序。在第六实施方案中，所述专利技术涉及编码所述突变多肽中的任一种的分离的核酸分子。优选地，所述分离的核酸分子具有选自以下的核苷酸序列：SEQIDNO:138[EgD5R*-34g157g]、SEQIDNO:140[EgD5R*-34g158a]、SEQIDNO:142[EgD5R*-34g158g]、SEQIDNO:144[EgD5R*-34h158a]、SEQIDNO:146[EgD5R*-34h158g]、SEQIDNO:148[EgD5R*-36s158a]、SEQIDNO:150[EgD5R*-36s158g]、SEQIDNO:152[EgD5M、密码子优化的EgD5R*-34g158g]、SEQIDNO:156[EgD5M1、密码子优化的EgD5R*-34g158g347s]、SEQIDNO:180[EgD5S-36s156e]、SEQIDNO:182[EgD5S-36s157g]、SEQIDNO:184[EgD5S-36s158a]、SEQIDNO:186[EgD5S-36s158g]、SEQIDNO:212[EaD5S-35a158g]、SEQIDNO:214[EaD5S-35a158s]、SEQIDNO:216[EaD5S-35a159g]、SEQIDNO:254[EgD5R-34g158g]、SEQIDNO:259[EgD5R-34g158a]、SEQIDNO:270[EaD5-35g159g]和SEQIDNO:275[EaD5-35g159a]。在第七实施方案中，本专利技术涉及表达所述突变多肽中的任一种的转化的宿主细胞。优选地，所述转化的宿主细胞选自：微生物，最优选含油酵母；以及植物，最优选油料种子植物。在第八实施方案中，所述转化的宿主细胞产生选自ω-6脂肪酸和ω-3脂肪酸的多不饱和脂肪酸。生物保藏下列生物材料保藏于美国典型培养物保藏中心（AmericanTypeCultureCollection）（ATCC）（10801UniversityBoulevard，Manassas，VA20110-2209），并具有下列名称、保藏号和保藏日期。上面列出的生物材料将按照国际承认的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约的有关条款来保存。所列出的保藏物将会被保持在指定的国际保藏机构中至少30年，并且一旦准予专利公开它就将会对公众开放。在由政府行为授予的专利权的部分废除中，保藏物的可用性不会构成实践主题专利技术的许可。根据如美国专利申请公布2010-0317072-A1所述的方法，解脂耶氏酵母Y9502来源于解脂耶氏酵母Y8412。附图说明和序列表图1A和图1B示出了ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径，并且当考虑下文对该途径的描述时应被视为是一起的。图2是小眼虫（Euglenagracilis）Δ-5去饱和酶的预测拓扑模型。图3A、3B、3C和3D示出了来自小眼虫的本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.08.26 US 61/377,248;2010.12.30 US 61/428,2771.具有Δ-5去饱和酶活性的突变多肽，其中所述突变多肽与SEQIDNO:21、SEQIDNO:25或SEQIDNO:29具有至少90％的氨基酸序列同一性，并且包含：(a)如SEQIDNO:11[HPGs]所示的氨基酸基序；和(b)如SEQIDNO:18[HDAgH]所示的氨基酸基序，其中所述突变多肽如SEQIDNO:187的氨基酸序列所示。2.根据权利要求1所述的突变多肽，其中所述突变多肽的二高-γ-亚麻酸至花生四烯酸的转化效率为亲本多肽的二高-γ-亚麻酸至花生四烯酸的转化效率的至少64％，所述亲本多肽包含与SEQIDNO:7[HPGG...
【专利技术属性】
技术研发人员：MW博斯蒂克，MD多伯特，H何，SP洪，DMW波拉克，PL夏普，YJ王，Z薛，NS亚达夫，H张，Q朱，
申请(专利权)人：纳幕尔杜邦公司，
类型：
国别省市：
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