一种罗非鱼激活素受体ⅡB重组蛋白的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种罗非鱼激活素受体ⅡB细胞外结构域基因片段。所述基因片段是以罗非鱼肌肉总RNA为模板，经RT-PCR和RACE方法而得到的罗非鱼激活素受体IIB基因，将罗非鱼激活素受体IIB基因克隆到载体pCR2.1中得到克隆载体pCR2.1-ActRIIB；以载体pCR2.1-ActRIIB为模板，设计罗非鱼激活素受体ⅡB细胞外结构域基因片段引物F和R，经PCR反应得到细胞外结构域基因片段；本发明专利技术还公开了一种含有罗非鱼激活素受体ⅡB细胞外结构域基因片段的表达载体pQE30-ActRIIB，将表达载体pQE30-ActRIIB导入大肠杆菌中进行表达获得罗非鱼激活素受体ⅡB重组蛋白，该蛋白可以应用于鱼苗苗种促生长剂或添加剂的制备。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程
，具体地，涉及一种罗非鱼激活素受体IIB重组蛋白的制备方法及其应用。
技术介绍
激活素(activin)属于转化生长因子β (TGF-β)超家族成员，是一类具有多种功能的生长和分化因子，具有调节垂体分泌卵泡刺激素(FSH)、促进红细胞系的分化等作用。激活素通过与靶细胞膜上的受体结合而传递信号，其受体分为两种类型即I型(ActRI)和II 型(ActR II )。激活素受体ActR (activin receptor)属于单次跨膜丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，由胞外结构域，跨膜结构域和胞内激酶结构域三部分组成。从AtT20细胞克隆的受体命名为激活素II型受体，目前在脊椎动物中发现两种激活素II型受体的存在，如ActRIIA或ACVR2，第二种激活素受体ActRIIB，或者称为ACVR2B。II型受体需要和I型受体结合形成二聚体才能发挥作用，I型受体招募并磷酸化受体调控的SMAD (R-SMAD), R-SMAD转位到细胞核中发挥转录因子的作用。ActRIIB有多种配体,如Myostatin通过与其结合调节肌肉生长。Myostatin，属TGF-beta超家族成员，是公认的肌肉生长的负调控因子。阻断Myostatin-ActRIIB-RSMAD途径对调控肌肉生长有重要意义。在小鼠，牛，狗等哺乳动物和金鱼等硬骨鱼中对该途径进行调控收到良好的临床上和生产上良好的效果。罗非鱼(Tilapia)，隶属于鲈形目、鲈形亚目、丽鱼科、罗非鱼属。目前被养殖的有15种，生长迅速，尤以幼鱼期生长更快。中国现已成为最大的罗非鱼生产国，截至2008年，我国罗非鱼产量占全球产量的49%。全球范围内对罗非鱼的需求仍在增加，使罗非鱼产量更快地增长是解决这一状 况的关键。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是为了满足罗非鱼需求的快速增长，公开了一种罗非鱼激活素受体IIB细胞外结构域基因片段。本专利技术的另一个目的是公开了一种罗非鱼激活素受体IIB蛋白的细胞外结构域。本专利技术的另一个目的是公开了一种罗非鱼激活素受体IIB基因。本专利技术的另一个目的是公开了一种罗非鱼激活素受体IIB蛋白。本专利技术的另一个目的是公开了扩增罗非鱼激活素受体IIB基因片段的引物。本专利技术的另一个目的是公开了一种含有罗非鱼激活素受体IIB细胞外结构域基因片段或罗非鱼激活素受体IIB基因的载体。本专利技术的另一个目的是公开了一种罗非鱼激活素受体IIB重组蛋白的制备方法。本专利技术的另一个目的是公开了一种罗非鱼激活素受体IIB重组蛋白在制备鱼苗苗种促生长剂或添加剂中的应用。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术予以实现的一种罗非鱼激活素受体IIB细胞外结构域基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所/Jn ο一种罗非鱼激活素受体IIB蛋白的细胞外结构域，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2 所示。一种罗非鱼激活素受体IIB基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。一种罗非鱼激活素受体IIB蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示。一对用于扩增罗非鱼激活素受体IIB基因片段引物，引物可以为F和R，其引物序列如SEQ ID NO: 5 6所示；或者引物为F7和R7，其序列如SEQ ID NO: 7 8所示；序列如SEQID NO: 5^6所示引物F和R是用于扩增罗非鱼激活素受体IIB细胞外结构域基因片段；序列如SEQ ID N0:7 8所示引物F7和R7是用于扩增罗非鱼激活素受体IIB基因的。进一步地，所述引物F含有KpnI内切酶位点，引物R含有终止密码子和HindIII内切酶位点。一种载体，所述载体包含SEQ ID NO:1或SEQ ID N0:3的基因片段。针对SEQ IDNO:1片段，该载体为大肠杆菌克隆载体pCR2.1-ActRIIB ;针对SEQ ID N0:3片段，载体为大肠杆菌表达载体pQE30- ActRIIB。进一步地，本专利技术提供了一种重组株，是由上述载体(表达载体)6转入大肠杆菌中所得。优选地，是上述 获得的表达载体PQE30- ActRIIB转入大肠杆菌M15中所形成的大肠杆菌重组株 PQE30- ActRIIB-M15。进一步地，本专利技术公开了一种罗非鱼激活素受体IIB重组蛋白的制备方法，包括如下步骤 51.将权利要求6或7所述表达载体转入大肠杆菌中，利用氨苄青霉素抗性基因筛选阳性转化子； 52.将阳性转化子接种在含有氨苄青霉素的液体培养基中，培养过夜，次日接种于相同培养基中，并经IPTG诱导，培养后收集菌体，经分离纯化得到重组罗非鱼激活素受体IIB。优选地，制备方法如下 51.将所述表达载体PQE30-ActRIIB转入大肠杆菌M15中，利用氨苄青霉素抗性基因筛选阳性转化子PQE30- ActRIIB-M15 ； 52.将阳性转化子pQE30-ActRIIB-M15接种在含有氨苄青霉素的液体培养基中，培养过夜，次日接种于相同培养基中，并经IPTG诱导，培养后收集菌体，经分离纯化得到重组罗非鱼激活素受体IIB。更优选地，步骤S2为将阳性转化子pQE30- ActRIIB-Ml5接种在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，370C，200转/分培养过夜，次日接种于相同培养基中，并经IPTG诱导，37°C，200转/分培养，10小时后收集菌体，经分离纯化得到重组罗非鱼激活素受体IIB。更优选的，步骤S2中所述IPTG的诱导浓度为lmmol/L。一种如上所述罗非鱼激活素受体IIB重组蛋白在制备鱼苗苗种促生长剂或添加剂中的应用。氨基酸序列分析表明罗非鱼激活素受体IIB成熟肽是罗非鱼激活素受体IIB原切除信号肽后的一个片段，既罗非鱼激活素受体IIB原第22位以后的氨基酸序列，而罗非鱼激活素受体IIB的胞外结构域则相当于23至134位氨基酸。游离形式的罗非鱼激活素受体IIB的胞外结构域能够与膜结合的受体竞争结合Myostatin等配体,进而发挥其促生长活性；本专利技术的罗非鱼激活素受体IIB全长基因是以激活素受体IIB罗非鱼肌肉总RNA反转录得到的cDNA为模板，经PCR和RACE方法扩增而得到的。总的来说，本专利技术用于表达罗非鱼ActRIIB胞外区重组蛋白的基因序列是以罗非鱼激活素受体IIB全长基因双链DNA为模板，经PCR方法扩增而得到的，它来源于罗非鱼激活素受体IIB胞外结构域所对应的基因片段。按照上述的罗非鱼ActRIIB重组蛋白的基因序列，它正好是罗非鱼激活素受体IIB全长基因67bp至402bp (相当于23位至134位氨基酸)的胞外区段，其核苷酸序列及其所编码的氨基酸序列如序列表所示。本专利技术还构建了含有上述罗非鱼ActRIIB胞外区重组蛋白的基因序列的载体；特别是含有该基因的大肠杆菌克隆载体以及表达载体。这些载体的构建方法是按常规方法，将通过PCR方法合成的罗非鱼激活素受体IIB基因经酶切和分离纯化后，接入到已有的相应载体的相应酶切位点(即Kpn I取HindIID之间，即构建成所需的含有罗非鱼激活素受体IIB基因的表达载体。上述含罗非鱼 激活素受体IIB基因的大肠杆菌表达载体优选由本专利技术合成的罗非鱼激活素受体IIB基因与大肠杆菌表达载体pQE30构建成的重组表达载体，命名为pQE30- ActRIIB本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种罗非鱼激活素受体IIB细胞外结构域基因片段，其特征在于核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.一种罗非鱼激活素受体IIB细胞外结构域基因片段，其特征在于核苷酸序列如SEQID NO:1 所示。2.一种罗非鱼激活素受体IIB蛋白细胞外结构域，其特征在于氨基酸序列如SEQ IDNO: 2所示。3.一种罗非鱼激活素受体IIB基因，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示。4.一种罗非鱼激活素受体IIB蛋白，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示。5.一对用于扩增罗非鱼激活素受体IIB基因片段引物，其特征在于引物序列如SEQ IDNO:5 6所示；或者引物序列如SEQ ID N0:7 8所示。6.一种载体，其特征在于含有权利要求1或3所述的基因片段。7.根据权利要求6所述载体，其特征在于，所述载体为大...

【专利技术属性】
技术研发人员：李文笙，邝中雷，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：