本发明专利技术涉及一种耐高温高碱木聚糖酶及其基因、工程菌和制备方法，其技术方案是利用易错PCR和定点突变技术对来源于坎皮纳斯类芽孢杆菌的木聚糖酶基因XynG1-1进行耐高温和高碱的定向分子改造，得到耐高温高碱的木聚糖酶突变基因XynG1-1B43CC16，并利用巨大芽孢杆菌表达系统，分泌表达耐高温高碱木聚糖酶的方法。本发明专利技术解决了现有木聚糖酶耐高温与耐碱性无法同时兼顾，造成其在造纸工业中应用受限的问题，满足了木聚糖酶在高温和高碱性环境下进行生物制浆和生物漂白的要求，可提高纸浆白度和得率，减少造纸工业中化学试剂的用量，降低环境污染，促进造纸工业的清洁生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程领域，涉及基因的随机突变和定点突变技术，尤其是。
技术介绍
木聚糖酶(l，4-0-D-xylanase;EC3.2. 1.8)是一种重要的工业用酶，在造纸工业、食品、能源、饲料以及环境等领域中显示了广阔的应用前景。特别是在纸浆生物漂白中的巨大应用潜力早已引起各界同行的高度关注。通过木聚糖酶对纸浆的预处理，不仅可以提高纸浆的白度，降低打浆的能耗，改善浆料的强度性能，而且，可以减少后继工序漂剂的用量，降低废液的毒性， 减轻环境污染。但到目前为止，工业上用于纸浆漂白的木聚糖酶大多是中性偏酸的，最适反应温度大多在50 60°C左右，最适作用pH在5. O 7. O左右，而纸浆蒸煮完毕时，温度为95 100°C，pH值为10 12，这就要求在加酶之前先将纸浆的pH和温度调到适合木聚糖酶作用的范围，从而使工艺流程复杂化并造成生产成本增加。随着木聚糖酶分子生物学研究的不断深入，应用基因工程以及蛋白质工程手段对现有木聚糖酶进行定向的分子改造有望解决这一问题。酶分子的定向进化是基于模拟体内蛋白分子的自然进化机制，通过体外随机突变和基因重组等方法构建随机突变文库，结合有益基因的定向筛选方案，从而可在相对较短时间内得到工业或市场所需要的性质优良的突变酶，该方法适用于空间结构和催化机制研究得并不清楚的蛋白的分子改造，在蛋白质工程中属于蛋白质的非理性设计。易错PCR是蛋白质分子定向进化的常用技术，通过对PCR体系中dNTP比例及Mg2+浓度的改变，并添加相应浓度的Mn2+，从而提高PCR过程中的错配率，以达到随机突变的效果。然而，就像自然进化是一个长期而复杂的积累过程一样，单纯通过一次易错PCR往往很难得到理想的结果，因此，通过多轮连续的易错PCR和合理的定向筛选方可得到有益突变的积累，有利于优良突变酶的获得。定点突变是改造及优化基因的最常用和最便捷的基因工程手段，它是在对蛋白分子结构和功能进行详尽的分析之后，从而有针对性的设计突变位点，达到迅速、高效的提高目的蛋白的性状及表征的目的，是一种理性的分子改造方案。而酶分子的定向改造是一个复杂而艰巨的任务，应用单一的改造技术很难达到预期目标，通常需要应用多种技术相结合的方法达到预期的改造目的。目前已有上百种来自于细菌和真菌的木聚糖酶基因得到了克隆和表达，研究细菌木聚糖酶基因的外源表达与调控的原核表达系统应用最多的是大肠杆菌表达系统，随着研究的发展，芽孢杆菌表达系统具有非致病性、分泌蛋白能力强和发酵基础良好等特性，逐步成为目前分泌表达外源蛋白较为理想的原核表达系统，但国内外对芽孢杆菌表达系统研究较多的是枯草芽孢杆菌表达系统，其他芽孢杆菌表达系统的报道却很少。巨大芽孢杆菌表达系统作为一种极具潜力的分泌型外源基因表达系统，具有表达率高、遗传稳定、产物可分泌、发酵工艺成熟等优点，近年来在工业以及学术研究领域得到了广泛的应用。国内外对木聚糖酶的研究已进入分子生物学阶段，Hirohito等从碱性菌株Bacillus sp. 4IM-1中克隆得到碱性木聚糖酶基因XynJ，通过在该酶的活性中心引进精氨酸突变，构建二硫桥，成功使其最适作用PH从8. 5上升到9. 5，这也是目前所研究的木聚糖酶的最适PH的最高水平，但其最适作用温度为65°C，仍属中温木聚糖酶，其在造纸高温环境中的应用仍受到一定的局限。而目前研究的最适作用温度最高的是一种来自于硫化叶菌属Sulfolobus solfataricus Oa的木聚糖酶,其最适作用温度为95°C,但其最适作用pH为3. 5,不适合在造纸工业的碱性环境中应用。在国内，木聚糖酶的最适作用温度最高为85°C,而其最适作用PH为6. 5，是2009年新疆大学的Wei Zhang等将嗜热网团菌的木聚糖酶基因xynB在Bacillus subtilis中表达的木聚糖酶；2008年,上海交通大学的Q. Wang等应用DNA shuffling和定点突变等技术对褐色嗜热单孢菌木聚糖酶进行定向改造，其最适作用pH 9. O为国内最高水平，而其最适作用温度为60°C。可见，目前开发的木聚糖酶难以兼顾耐高温、耐高碱性及高活力的特性，不能适应造纸工业高温高碱性的极端应用环境的要求。因此，为促进造纸工业的清洁生产，亟待开发一种在闻温、闻pH值条件下具有闻活力的耐闻温闻喊木聚糖酶。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处，提供，本专利技术制备获得的该耐高温高碱木聚糖酶，其最适作用温度70°C，最适作用pH为9. O,并且在高温和高碱的条件下较稳定，90°C保温2h，残余酶活为38. 2%，而原始酶XynGl-1的酶活则完全丧失；在pHll. O条件下保存3h，残余酶活为44%，比原始酶XynGl-1提高了 57%。 本专利技术实现目的的技术方案如下—种耐闻温闻喊木聚糖酶基因，其基因序列为序列13。一种耐高温高碱木聚糖酶基因的构建方法，应用两轮连续易错PCR方法对坎皮纳斯类芽孢杆菌木聚糖酶基因XynGl-1进行随机突变和耐碱性的定向筛选，得到耐碱性木聚糖酶突变基因XynGl-lB43，其突变位点为Val90Arg和Prol72His ;所述坎皮纳斯类芽孢杆菌木聚糖基因XynGl-1为序列11，耐碱性木聚糖酶突变基因XynGl_lB43为序列12，应用定点突变的方法对序列12的耐碱性木聚糖酶突变基因XynGl-lB43进行耐高温的定向分子改造，得到耐高温高碱木聚糖酶的突变基因XynGl-lB43CC16，其突变位点为Aspl6Tyr、Thr84Cys 和 Thrl82Cys。一种高产耐高温高碱木聚糖酶的工程菌，含耐高温高碱木聚糖酶基因。而且,所述工程菌的宿主细胞为Bacillus megaterium MS941。而且，所述工程菌中的表达载体为大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒PSTREPHIS1525。—种耐闻温闻喊木聚糖酶，具有基因序列为序列13所述的基因编码的蛋白序列。而且，由上述述的工程菌发酵得到。而且,所述的木聚糖酶的最适作用温度为70°C,最适作用pH为9. O。一种耐高温高碱木聚糖酶的制备方法，其特征在于步骤如下⑴对坎皮纳斯类芽孢杆菌木聚糖酶基因(XynGl-1)进行随机突变和耐碱性的定向筛选，得到耐碱性木聚糖酶突变基因(XynGl-lB43)，其突变位点为Val90Arg和Prol72His ;所述坎皮纳斯类芽孢杆菌木聚糖酶基因(XynGl-1)见序列11 ；⑵对耐碱性木聚糖酶突变基因(XynGl_lB43)进行定点突变，突变位点为Aspl6Tyr、Thr84Cys和Thrl82Cys,得到耐高温高碱木聚糖酶基因(XynGl_lB43CC16),所述耐碱性木聚糖酶突变基因(XynGl-lB43)见序列12 ；⑶将上述耐闻温闻喊木聚糖酶基因与表达载体连接，构建获得携带有耐闻温闻喊木聚糖酶基因的重组载体；⑷将重组载体转化入宿主菌株中，构建获得重组菌株；(5)重组菌株分泌表达，发酵制备耐高温高碱木聚糖酶。本专利技术的优点和积极效果如下1、本专利技术利用易错PCR和定点突变技术，对坎皮纳斯类芽孢杆菌木聚糖酶基因进行定向改造，获得耐高温高碱木聚糖酶基因XynGl-lB43CC16(V90R/P172H/T84C-T182C/D16Y)，并通过分泌型表达载体，转化本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种耐高温高碱木聚糖酶基因，其特征在于：其基因序列为序列13。
【技术特征摘要】
1.一种耐闻温闻喊木聚糖酶基因，其特征在于其基因序列为序列13。2.一种耐高温高碱木聚糖酶基因的构建方法，其特征在于应用两轮连续易错PCR方法对坎皮纳斯类芽孢杆菌木聚糖酶基因XynGl-1进行随机突变和耐碱性的定向筛选，得到耐碱性木聚糖酶突变基因XynGl-lB43，其突变位点为Val90Arg和Prol72His ;所述坎皮纳斯类芽孢杆菌木聚糖基因XynGl-1为序列11，耐碱性木聚糖酶突变基因XynGl-lB43为序列12，应用定点突变的方法对序列12的耐碱性木聚糖酶突变基因XynGl-lB43进行耐高温的定向分子改造，得到耐高温高碱木聚糖酶的突变基因XynGl-lB43CC16，其突变位点为Asp16Tyr、Thr84Cys 和 Thrl82Cys。3.一种高产耐高温高碱木聚糖酶的工程菌，其特征在于含有如权利要求1所述的耐高温高碱木聚糖酶基因。4.根据权利要求4所述的高产耐高温高碱木聚糖酶的工程菌，其特征在于所述工程菌的宿主细胞为 Bacillus megaterium MS941。5.根据权利要求3或4所述的高产耐高温高碱木聚糖酶的工程菌，其特征在于所述工程菌中的表达载体为大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒PSTREPHIS1525。6.一种耐高温...
【专利技术属性】
技术研发人员：路福平，刘逸寒，郑宏臣，樊帅，王春霞，王建玲，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：
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