一种底物亲和力强的甘露聚糖酶的设计与制备。本发明专利技术提出了一种底物亲和力强的AusMan5AY111F与AusMan5AY115F突变酶的设计与构建的方法，通过序列同源性分析、同源建模、结合能的计算等最终确定突变位点，大引物PCR得到的相应的基因命名为Ausman5AY111F、man5AY115F。本发明专利技术还公开了突变酶工程菌的构建以及高效表达和纯化的方法，制备的突变酶具有底物亲和力强、催化效率高的特性，具有较大的工业化生产潜力和经济价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程和蛋白质表达领域，尤其涉及AuSMan5AY111F和AusMan5AY115F 酶基因的构建和表达，以及该酶的性质和制备的研究。
技术介绍
β -甘露聚糖酶(β-1,4-D-mannan mannohydrolase, EC 3.2.1.78)是一种能从均一甘露聚糖和异甘露聚糖主链的内部降解β_1，4-甘露糖苷键的水解酶，属于半纤维素酶类，其广泛地存在于微生物、植物和动物中。它可以广泛应用于食品、医药、饲料、造纸、印染和石油工业等领域。在食品和医药领域，β-甘露聚糖酶作用于甘露聚糖后可以产生功能性低聚糖，这种低聚糖可以有效地降低人体血糖和胆固醇水平且有利于人和动物肠道内益生菌群的生长，进而调节人和动物的免疫系统、提高免疫力。在饲料工业中，它作为饲料添加剂能有效降解植物细胞壁中的甘露聚糖成分，消除抗营养因子，提高能量利用率、改善饲料转化率。在造纸工业中，β_甘露聚糖酶和β_木聚糖酶等半纤维素降解酶类协同使用， 处理纸浆，能明显改善纸质。将β_甘露聚糖酶运用纺织印染的漂白工艺中，能有效地去除产品上粘附的多余染料，更可以减少氯和碱的用量以及它们带来的环境污染问题，有利于生态环境的保护。目前已报道的能产β_甘露聚糖酶的微生物主要来自于细菌、真菌和放线菌，例如细菌中的枯草芽孢杆菌，真菌中的曲霉、木霉、青霉、酵母，以及放线菌中的链霉菌等。目前，关于第5家族β -甘露聚糖酶的报道较多，它们的最适pH值为3. O 7. 5，最适温度在45 92°C。近年来，随着对自然界中半纤维素资源的开发、饲粮中甘露聚糖抗营养因子的消除以及甘露寡糖生理功能的 发现，甘露聚糖酶的需求量越来越大，导致对甘露聚糖酶的研究和开发进入一个新高潮。但就国内外相关文献或专利报道来看，微生物β_甘露聚糖酶发酵酶活性普遍不高，导致了生产成本很高，从而阻碍了该酶在众多领域中的广泛应用。为了提高甘露聚糖酶的发酵产率和酶活性，早期的研究工作主要集中在产酶菌种的筛选、诱变、产酶诱导，酶的分离纯化及性质，酶水解底物方式及应用等方面。进入90 年代，随着基因工程技术和蛋白质工程技术的广泛应用，研究工作逐步转向酶基因的克隆和表达以及酶活性位点的研究等方面。目前，虽已有一些有关甘露聚糖酶基因的克隆和表达的文献和专利报道，但有关基于理性设计的甘露聚糖酶的分子改造，尤其是关于甘露聚糖酶亲和力的分子改造研究未见有报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种底物亲和力不同的AuSMan5AY111F和AusMan5AY115F酶的设计与构建的方法，对原有的宇佐美曲霉Man5A进行了分子改造。本专利技术的技术方案综合考虑分子对接、同源建模、结合能计算、同源性分析等因素确定宇佐美曲霉AusMan5A基因突变位点，设计特异性突变引物，构建突变酶基因 AusMan5AY111F和AusMan5Ayi15f,并成功实现其在毕赤酵母中的表达及酶动力学参数的测定。携带有宇佐美曲霉Aus Man5A基因的重组质粒pUCm-T_man5A由江南大学构建和保藏(专利申请号:201010550927. 4)。所述的突变酶的活性测定方法于25mL具塞试管A和B中，各加入用pH 4. 8乙酸-乙酸钠缓冲液配制的质量浓度为O. 5%的角豆胶溶液2. 4mL，50°C预热lOmin，在A管中加入O.1mL适当稀释的酶液，50°C 准确反应IOmin ;立即各加入2. 5mL 3'，5' - 二硝基水杨酸(DNS)试剂，在B管中再补加 O.1mL酶液，A和B管均煮沸7min ;冷却后各加去离子水5mL，摇匀；540nm处以B管为空白对照测定A管吸光度值，并从甘露糖标准曲线上查出相应的还原糖(以甘露糖计)含量并折算成酶活性单位。酶活性单位定义在本测定条件下，以每分钟产生I μ mol还原糖所需的酶量定义为I个β -甘露聚糖酶活性单位(IU)。所述的酶基因的构建和表达的方法(I)突变位点的确定根据 Carbohydrate-Active enzymes Database (http:// WWW. cazy. org/)中收录的信息,收录与Km值有关地文献。(2)甘露聚糖酶与甘露二糖的对接和分子动力学模拟同源建模获得AusMan5A及的三维结构，与甘露二糖用Aut0D0Ck4. 2软进行分子对接，统计出结合域距酸碱催化位点亲核催化位点8A内的氨基酸，同源性分析排除保守位点氨基酸，根据氨基酸的性质、空间结果及位置等选择多个点进行同源建模，获得突变酶的三维结构，并计算原酶及突变酶与甘露二糖之间的结合能，综合以上因素选择分别将111、115位酪氨酸突变为苯丙氨酸。(3)突变酶AusMan5AY111F和AusMan5AY115F基因的获得基于上面设计的突变位点， 设计并合成特异性定点突变引物如下Y115F 5/ -ACGCAGACATACCACCAAAATCGGTCCAGT-3'，宇佐美曲霉 Aus Man5A 的基因片段的中间特异性引物；YlllF 5/ -AATCGGTCCAGAAGTTGACGAAGT-3'，宇佐美曲霉 Aus Man5A 的基因片段的中间特异性引物；·根据原酶基因序列设计并合成上下游引物如下AMan5A-F 5/ -GAATTCTCCTTCGCCAGCACCTC-3'，宇佐美曲霉 Aus Man5A 的基因片段的上游引物；AMan5A-R 5/ -TTGTACCGCCGGCACTATCAATAGCAGCAA-3 '，宇佐美曲霉 Aus Man5A 的基因片段的下游引物；先分别以pUCm-T-man5A为模板以上游引物和中间特异性引物为引物PCR合成大引物，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳分析并割胶回收目的条带。然后各取2μ1大引物、O. 5 μ I下游引物以pUCm-T-man5A为模板进行PCR获得突变酶基因，将PCR产物用I %琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T-man5AY111F、 pUCm-T-man5AY115F)，转化JM109感受态细胞，经蓝白斑筛选选择正确的重组子送上海生工测序。将测序结果正确的pUCm-T-man5AY111F、pUCm-T-man5AY115F 与 pPIC9K 质粒均用 EcoR I和Not I进行双酶切，割胶回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9K-man5AY111F、pPIC9K_man5AY115F(图1)，并对重组质粒进行序列测定。(4)GS115/man5AY111F、GS115/man5AY111F 的构建、表达、产物纯化及活性测定用 SalI分别对pPIC9K-man5AY111F、pPIC9K_man5AY115F进行线性化,按照毕赤酵母表达手册进行电转、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/man5AY111F、GS115/man5AY111F ;按照手册上的标准流程进行诱导表达，用DNS法测定突变酶的甘露聚糖酶活性；发酵液经冷冻离心、硫酸铵盐析、离子交换层析和凝胶过滤层析，得到电泳纯的突变酶。(5)突变酶动力学常数的测定分别取不同浓度的角豆胶(I 10mg/mL)按照酶活测定的条件测定水解反应速率，然后用双倒数作图的方法算出Km和本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种源自宇佐美曲霉(Aspergillus?usamii)E001的甘露聚糖酶的定向改造酶AusMan5AY111F和AusMan5AY115F，其核苷酸序列对应于序列表中的SEQ?ID?NO：1和SEQ?IDNO：3。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李剑芳，胡蝶，汪俊卿，魏喜换，赵梅，邬敏辰，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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