本发明专利技术公开了尼罗罗非鱼几丁质酶基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。该基因是以尼罗罗非鱼中肠组织的总RNA为模板，利用同源重组比对，RT-PCR以及RACE方法而获得的包含尼罗罗非鱼几丁质酶全长cDNA序列的基因片段；本发明专利技术还利用毕赤酵母构建了该基因的分泌表达载体和工程菌株；利用本发明专利技术可以获得来源稳定，成本便宜的罗非鱼几丁质酶重组蛋白。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物基因工程
，具体地，涉及一种尼罗罗非鱼几丁质酶基因及其重组蛋白的制备与应用。
技术介绍
几丁质酶(EC 3. 2.1. 14)是一种糖苷水解酶，可以作用于几丁质使其脱去N-乙酰氨基葡萄糖。几丁质酶可以分为内切酶和外切酶。内切酶从几丁质内部断开糖苷键，形成低 分子量的N-乙酰氨基葡萄糖聚合物；外切酶则从几丁质的一端分别切下壳二糖，或者N-乙酰氨基葡萄糖的单体，进而降解几丁质。几丁质酶在自然界分布广泛，大部分的原核生物和真核生物中均有发现。鱼类中，最初是在海鲷的胃肠道中检测到有几丁质酶活性，但由于技术限制，对于这种几丁质酶活性是由胃肠道内的微生物，或者捕食的食物本身，还是由鱼体本身产生的不能确定。随着分子技术的发展，及斑马鱼中几丁质酶类似EST的发现，首先在日本比目鱼中利用同源序列比对的方法克隆获得了三种几丁质酶，接着在其他鱼类中的几丁质酶克隆研究逐渐开展起来。目前已经在日本比目鱼，斜带石斑鱼，条文鲈，虹鳟，黑青斑河豚，白姑鱼，欧式六线鱼和三线鸡鱼中获得了几丁质酶序列。几丁质是β- (1，4)_连接的N-乙酰氨基葡萄糖的聚合物，根据内部分子的排列方式，存在α、β和Y三种形式。几丁质在自然界分布广泛，蕴藏量仅次于纤维素，在细菌类，真菌类和硅藻类的细胞壁，节肢昆虫类，海洋节肢动物类的外壳以及乌贼中都含有。在海洋生物中，几丁质的产量达到每年101°到IO11公吨。大多数形式的几丁质复合物可以抵制化学降解，但在自然界中也很少看到大面积持续存在的几丁质碎屑，因而在自然界中应当存在一些可以降解几丁质的酶，迅速的将几丁质降解循环利用。另外，几丁质是天然糖中唯一大量存在的碱性氨基多糖，具有众多特殊的理化性质和生理功能，在农业和食品等领域都有很高的使用价值，但几丁质分子量大，难溶于水，限制了几丁质的应用。几丁质的降解产物壳寡糖，分子量相对较小，也可溶于水，多位学者对其研究发现，壳寡糖也可以在农业和食品等领域拥有几丁质类似的应用价值，另外在降血压、血糖、血脂，增强免疫力、抗疾病能力以及调节肠道微生物的生态平衡有作用。还可进行加工用于污水处理和输送药物，此外纯化加工后的硫化壳六糖对一些相关的肿瘤具有抑制作用。因而对壳寡糖的研究具有重要的意义。目前生产壳寡糖主要通过几丁质部分去乙酰化形成壳多糖，再经过化学法，物理法或酶解法降解壳多糖进行生产。但化学法存在明显的缺陷生产条件较为苛刻，制备过程中要使用大量的化学试剂，对环境危害较大，并且化学法生产的壳寡糖，因为随机断裂糖苷键，产生的分子大小分布较宽。物理方法生产壳寡糖的机制也是随机断裂壳聚糖的糖苷键，因而生产的产物也是分子大小分布较宽，不利于获得相对较纯的壳寡糖。而壳寡糖众多的医药应用价值大多都是相对单一的壳寡糖在起作用。酶解法生产壳寡糖具有明显的优势，不仅对环境危害小，另外通过对酶解条件的调整可能获得相对分子大小分布较窄的壳聚糖，进而方便纯化及应用。酶解法可分为专一性酶解法和非专一性酶解法。常用的非专一性酶主要由溶菌酶，脂肪酶，蛋白酶和纤维素酶。这些酶容易得到，价格低廉，因而曾在一段时间作为壳寡糖的主要生产方法，但专一性不高，依然得不到理想聚合度的壳寡糖。近年来随着表达技术的发展，获得各种原核和真核重组的几丁质酶，也逐渐应用于壳寡糖的生产，虽然目前对几丁质酶的作用机制了解较少，但通过条件的摸索希望可以获得一些相对聚合度符合的壳寡糖的降解条件。几丁质酶有着广泛的功能，在昆虫和甲壳类等含几丁质的物种中，几丁质酶可以协助蜕皮。在哺乳动物中发现，一些几丁质酶诸如壳三糖酶可以作为哮喘等炎症的指示剂。在鱼类中，一些几丁质酶分布于免疫器官，但由于获得具有活性的几丁质酶蛋白比较有困难等原因，对鱼类中几丁质酶的功能研究受到限制。目前鱼类中所获得的几丁质酶的类型相对较少，来源相对单一，以上所获得几丁质酶序列信息的鱼类均属于肉食性，在草食性和 杂食性的鱼类中目前尚未获得几丁质酶的信息，制约了鱼类中是否存在其他类型的几丁质酶和不同食性的鱼类中几丁质酶是否存在结构和功能的区别的研究。罗非鱼(Tilapia)俗称非洲鲫鱼，属于鲈形目，鲈形亚目，丽鱼科。与其他已获得几丁质酶序列的鱼类不同，罗非鱼属杂食性鱼类。巴西学者曾在尼罗罗非鱼的血液，肠道和胃内检测到几丁质酶活性，但由于技术限制等原因目前没有获得相关的基因序列信息或蛋白信息。毕赤酵母是一种真核表达系统，具有类似原核表达系统的易操作性，同时具有真核生物的翻译后修饰功能。同时毕赤酵母具有易培养，安全性高，可以进行发酵和大规模培养等特点，易于获得大量的外源重组蛋白。相对于其他表达系统，利用毕赤酵母表达系统进行有功能蛋白的研究比较有优势。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是为了克服现有技术的不足，公开了一种尼罗罗非鱼几丁质酶基因。本专利技术的另一个目的是公开了一种尼罗罗非鱼几丁质酶。本专利技术的另一个目的是公开了一对克隆尼罗罗非鱼几丁质酶基因的引物。本专利技术的另一个目的是公开了一种载体，所述载体含有罗非鱼几丁质酶基因。本专利技术的另一个目的是公开一种尼罗罗非鱼几丁质酶重组蛋白的制备方法。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案予以实现的 一种尼罗罗非鱼几丁质酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。一种尼罗罗非鱼几丁质酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。一对克隆尼罗罗非鱼几丁质酶基因的引物，引物序列如SEQ ID N0:3 4所示。一种载体，所述载体含有罗非鱼几丁质酶基因。优选地，所述载体为克隆载体T4_Cht，或者所述的载体为毕赤酵母表达载体pPICZa A-tchto一种重组株，是由如上所述含有罗非鱼几丁质酶基因的载体转化毕赤酵母得到的。优选地,重组株是由如上所述毕赤酵母表达载体pPICZa A-tcht转入毕赤酵母X33中得到的。一种尼罗罗非鱼几丁质酶重组蛋白的制备方法，包括如下步骤 51.将权利要求4或5所述表达载体转入毕赤酵母中，利用抗生素抗性基因筛选阳性转化子； 52.将阳性转化子接种在含甘油碳源的培养基中，培养过夜，次日更换为含甲醇碳源的培养基中进行诱导培养，每If 24hr进行一次甲醇添加，收集上清；S3.将上清过镍离子柱后用5(T250mM咪唑洗涤柱子，收集洗涤液即得重组蛋白。优选地，步骤SI所述诱导培养的最优条件为诱导培养基的pH值为5. 0，甲醇的诱导终浓度为O. 5%，诱导时间为48小时，诱导培养基中吐温-80的浓度为O. 4%。一种如上所述尼罗罗非鱼几丁质酶重组蛋白在降解几丁质制备壳寡糖中的应用。 进一步地，所述尼罗罗非鱼几丁质酶重组蛋白降解几丁质的酶解条件为采用PH为4飞的缓冲体系，每10(Γ500份重量的壳聚糖添加f 10份重量的几丁质酶28°C 37°C反应Γ3小时。所述缓冲体系可以采用柠檬酸-磷酸氢二钠配制而成。优选地，可利用5^50ug的几丁质酶，降解O. 5^2. 5mg的壳聚糖， 本专利技术利用同源序列比对和RACE方法进行尼罗罗非鱼几丁质酶基因的克隆。通过将其他物种中所获得几丁质酶序列进行比对，进行简并引物的设计。利用Trizol Reagent进行中肠组织RNA的提取，利用反转录试剂盒，进行RT-PCR获得中肠组织的cDNA。接下来利用所设计简并引物进行尼罗罗非鱼几丁质酶中间本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种尼罗罗非鱼几丁质酶基因，其特征在于核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。
【技术特征摘要】
1.一种尼罗罗非鱼几丁质酶基因，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。2.一种尼罗罗非鱼几丁质酶，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。3.一对克隆尼罗罗非鱼几丁质酶基因的引物，其特征在于引物序列如SEQ ID NO:3^4所示。4.一种载体，其特征在于，含有权利要求1所述的罗非鱼几丁质酶基因。5.根据权利要求4所述载体，其特征在于，所述载体为克隆载体T4-Cht，或者所述的载体为毕赤酵母表达载体PPICZa A-tcht。6.一种重组株，其特征在于，是由权利要求4所述载体转化毕赤酵母得到的。7.—种尼罗罗非鱼几丁质酶重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤 51.将权利要求4或5所述表达载体转入毕赤酵母中，利用抗生素抗性基因筛选阳性转化子； 52.将阳性转化子...
【专利技术属性】
技术研发人员：李文笙，李波，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：
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