本发明专利技术公开了一种制备丙氨酸转氨酶的方法，该方法包括：改造全基因合成人源化丙氨酸转氨酶编码基因序列，去除大肠杆菌稀有密码子；将改造后的丙氨酸转氨酶编码基因序列插入表达载体中，并用大肠杆菌菌株转化表达；将转化表达菌株接种于LB培养基，IPTG诱导；所得菌体破菌，离心分离，过Ni-NTA柱纯化；本发明专利技术制备丙氨酸转氨酶操作非常简单，制备成本低，成品产率高，纯度高而且具有高生物活性，作为抗原物质可进行动物免疫，筛选相关抗体，同时为尽快建立国内临床化学诊断急需的校准品制备平台，研制诊断试剂标准物质和参考品奠定基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程和蛋白表达领域，涉及一种用生物工程技术高效制备丙氨酸转氨酶的方法，产物可作为抗原物质进行动物免疫，筛选相关抗体，同时为临床化学诊断所需校准品、标准物质和参考品的制备开发奠定基础。
技术介绍
丙氨酸转氨酶(alanineaminotransferase, ALT, EC2. 6.1. 2)是谷氨酸和丙酮酸之间的转氨酶，又名谷丙转氨酶，简称GPT、ALT。谷丙转氨酶升高在临床是很常见的现象。肝脏是人体最大的解毒器官，该脏器是不是 正常，对人体来说是非常重要的。GPT升高是肝脏功能出现问题的一个重要指标。在常见的因素里，各类肝炎都可以引起GPT升高，这是由于肝脏受到破坏所造成的。一些药物如抗肿瘤药、抗结核药，都会引起肝脏功能损害。大量喝酒、食用某些食物也会引起肝功能短时间损害。GPT主要存在于肝细胞浆内，其细胞内浓度高于血清中1000-3000倍。只要有1%的肝细胞坏死，就可以使血清酶增高一倍。临床上有很多疾病可引起转氨酶异常1.病毒性肝炎这是引起转氨酶增高最常见的疾病，各类急、慢性病毒性肝炎均可导致转氨酶升高。2.中毒性肝炎多种药物和化学制剂都能引起转氨酶升高，但停药后，转氨酶可恢复正常。3.大量或长期饮酒者谷丙转氨酶也会升高。4.肝硬化与肝癌肝硬化活动时，转氨酶都高于正常水平，应该积极治疗。5.胆道疾病胆囊炎、胆石症急性发作时，常有发热、腹痛、恶心、呕吐、黄疸、血胆红素及转氨酶升高6.心脏疾病急性心肌梗塞、心肌炎、心力衰竭时，谷丙转氨酶和谷草转氨酶均升高，患者常有胸痛、心悸、气短、浮肿。心脏检查有阳性体征及心电图异常。7.其他某些感染性疾病，如肺炎、伤寒、结核病、传染性单核细胞增多症等，都有转氨酶升高的现象。因此，GPT被世界卫生组织推荐为肝功能损害最敏感的检测指标。谷丙转氨酶的正常参考值为O 40U/L。我国幅员辽阔，人口众多，临床诊断试剂市场巨大，前景广阔。就国内的现状来说，我国的诊断试剂行业仍处于成长初期，即产品研发与生产的投入初期，成长期还没有真正到来，而我国诊断试剂市场规模约为全球市场的1/14，有较大的成长空间。研制价廉物美的诊断试剂产品无疑是非常必要且具重要意义的。目前国外的产品通常是把试剂、参考品(校准品、质控品)、仪器作为一个系统(封闭系统)推入市场，在检测重复性、准确性上有很大的优势，并且具有市场垄断性。国内主要的诊断试剂生产厂家几乎都没有生产相应质控品的经验和实力，市场上认可的国产产品寥寥无几。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种操作简单、制备成本低廉，成功率高的制备丙氨酸转氨酶的方法。1.为实现上述目的，本专利技术一种制备丙氨酸转氨酶的方法，该方法包括I)改造并全基因合成人源化丙氨酸转氨酶编码基因序列，去除大肠杆菌稀有密码子;2)将步骤I)中改造后的丙氨酸转氨酶编码基因序列插入表达载体中，并用大肠杆菌菌株转化表达；3)将转化表达菌株接种于LB培养基，IPTG诱导；4)所得菌体破菌，离心分离，过N1-NTA柱纯化；其中，步骤I)中改造后的全基因合成人源化丙氨酸转氨酶编码基因序列为ATGGCTTCTT CTACTGGTGA TCGTTCTCAG GCTGTTCGTC ATGGTCTGCG TGCGAAAGTTCTGACCCTGG ACGGCATGAA CCCGCGTGTT CGTCGCGTCG AATACGCCGT GCGTGGCCCGATCGTTCAGC GTGCTCTGGA ACTGGAACAA GAACTGCGTC AGGGCGTTAA AAAGCCGTTCACCGAGGTTA TCCGCGCCAA CATCGGCGAT GCCCAGGCTA TGGGTCAGCG TCCTATCACCTTCCTGCGCC AGGTCCTGGC GCTGTGCGTA AACCCAGACC TGCTGAGCTC TCCGAACTTCCCGGACGACG CTAAGAAACG TGCGGAACGC ATCCTGCAGG CATGCGGTGG CCACAGCCTGGGCGCTTACA GCGTTTCCTC CGGTATCCAG CTGATTCGTG AAGATGTTGC CCGTTACATCGAGCGCCGTG ATGGCGGTAT CCCGGCGGAC CCTAACAACG TATTCCTGTC TACCGGTGCGTCCGATGCCA TTGTTACCGT TCTGAAGCTG CTGGTGGCTG GCGAGGGTCA CACCCGTACCGGTGTCCTGA TTCCGATTCC ACAGTATCCG CTGTATTCTG CTACTCTGGC TGAACTGGGTGCGGTGCAGG TAGACTATTA CCTGGATGAG GAGCGCGCTT GGGCGCTGGA CGTCGCAGAGCTGCACCGCG CACTGGGCCA GGCACGTGAC CACTGCCGTC CGCGTGCGCT GTGCGTGATTAACCCGGGCA ACCCGACGGG CCAAGTTCAG ACCCGTGAAT GCATCGAAGC TGTGATTCGTTTTGCTTTCG AAGAACGTCT GTTCCTGCTG GCGGACGAAG TTTATCAGGA CAACGTTTACGCAGCCGGTA GCCAGTTTCA TTCTTTCAAG AAAGTTCTGA TGGAAATGGG TCCGCCGTATGCGGGTCAGC AAGAACTGGC ATCCTTCCAC TCTACCTCCA AAGGTTATAT GGGTGAGTGTGGCTTCCGTG GTGGTTATGT TGAAGTAGTT AATATGGACG CGGCTGTGCA GCAGCAGATGCTGAAGCTGA TGTCTGTGCG CCTGTGCCCG CCTGTGCCGG GTCAAGCCCT GCTGGATCTGGTTGTGTCTC CGCCTGCTCC GACTGATCCG TCCTTCGCAC AATTCCAGGC TGAGAAACAGGCCGTTCTGG CGGAACTGGC AGCGAAAGCC AAACTGACGG AACAAGTGTT CAACGAAGCGCCGGGTATCT CCTGCAATCC GGTACAAGGC GCGATGTATA GCTTCCCGCG CGTTCAGCTGCCGCCACGCG CAGTAGAACG TGCACAGGAA CTGGGCCTGG CTCCGGACAT GTTCTTCTGTCTGCGCCTGC TGGAAGAAAC CGGTATTTGC GTTGTACCTG GCAGCGGCTT CGGTCAACGTGAAGGTACTT ACCACTTCCG TATGACCATC CTGCCTCCGC TGGAAAAACT GCGTCT GCTGCTGGAAAAGC TGTCCCGTTT TCACGCGAAA TTCACTCTGG AATATTCTTA G进一步,步骤2)中所述表达载体为pRSF Duet, pET表达系列。进一步，步骤2)中所述大肠杆菌菌株为BL21 (DE3)，Rosetta (DE3)。进一步，所述BL21(DE本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种制备丙氨酸转氨酶的方法，其特征在于，该方法包括：1)改造并全基因合成人源化丙氨酸转氨酶编码基因序列，去除大肠杆菌稀有密码子；2)将步骤1)中改造后的丙氨酸转氨酶编码基因序列插入表达载体中，并用大肠杆菌菌株转化表达；3)将转化表达菌株接种于LB培养基，IPTG诱导；4)所得菌体破菌，离心分离，过Ni?NTA柱纯化；其中，步骤1)中改造后的全基因合成人源化丙氨酸转氨酶编码基因序列为：ATGGCTTCTT?CTACTGGTGA?TCGTTCTCAG?GCTGTTCGTC?ATGGTCTGCG?TGCGAAAGTTCTGACCCTGG?ACGGCATGAA?CCCGCGTGTT?CGTCGCGTCG?AATACGCCGT?GCGTGGCCCGATCGTTCAGC?GTGCTCTGGA?ACTGGAACAA?GAACTGCGTC?AGGGCGTTAA?AAAGCCGTTCACCGAGGTTA?TCCGCGCCAA?CATCGGCGAT?GCCCAGGCTA?TGGGTCAGCG?TCCTATCACCTTCCTGCGCC?AGGTCCTGGC?GCTGTGCGTA?AACCCAGACC?TGCTGAGCTC?TCCGAACTTCCCGGACGACG?CTAAGAAACG?TGCGGAACGC?ATCCTGCAGG?CATGCGGTGG?CCACAGCCTGGGCGCTTACA?GCGTTTCCTC?CGGTATCCAG?CTGATTCGTG?AAGATGTTGC?CCGTTACATCGAGCGCCGTG?ATGGCGGTAT?CCCGGCGGAC?CCTAACAACG?TATTCCTGTC?TACCGGTGCGTCCGATGCCA?TTGTTACCGT?TCTGAAGCTG?CTGGTGGCTG?GCGAGGGTCA?CACCCGTACCGGTGTCCTGA?TTCCGATTCC?ACAGTATCCG?CTGTATTCTG?CTACTCTGGC?TGAACTGGGTGCGGTGCAGG?TAGACTATTA?CCTGGATGAG?GAGCGCGCTT?GGGCGCTGGA?CGTCGCAGAGCTGCACCGCG?CACTGGGCCA?GGCACGTGAC?CACTGCCGTC?CGCGTGCGCT?GTGCGTGATTAACCCGGGCA?ACCCGACGGG?CCAAGTTCAG?ACCCGTGAAT?GCATCGAAGC?TGTGATTCGTTTTGCTTTCG?AAGAACGTCT?GTTCCTGCTG?GCGGACGAAG?TTTATCAGGA?CAACGTTTACGCAGCCGGTA?GCCAGTTTCA?TTCTTTCAAG?AAAGTTCTGA?TGGAAATGGG?TCCGCCGTATGCGGGTCAGC?AAGAACTGGC?ATCCTTCCAC?TCTACCTCCA?AAGGTTATAT?GGGTGAGTGTGGCTTCCGTG?GTGGTTATGT?TGAAGTAGTT?AATATGGACG?CGGCTGTGCA?GCAGCAGATGCTGAAGCTGA?TGTCTGTGCG?CCTGTGCCCG?CCTGTGCCGG?GTCAAGCCCT?GCTGGATCTGGTTGTGTCTC?CGCCTGCTCC?GACTGATCCG?TCCTTCGCAC?AATTCCAGGC?TGAGAAACAGGCCGTTCTGG?CGGAACTGGC?AGCGAAAGCC?AAACTGACGG?AACAAGTGTT?CAACGAAGCGCCGGGTATCT?CCTGCAATCC?GGTACAAGGC?GCGATGTATA?GCTTCCCGCG?CGTTCAGCTGCCGCCACGCG?CAGTAGAACG?TGCACAGGAA?CTGGGCCTGG?CTCCGGACAT?GTTCTTCTGTCTGCGCCTGC?TGGAAGAAAC?CGGTATTTGC?GTTGTACCTG?GCAGCGGCTT?CGGTCAACGTGAAGGTACTT?ACCACTTCCG?TATGACCATC?CTGCCTCCGC?TGGAAAAACT?GCGTCTGCTGCTGGAAAAGC?TGTCCCGTTT?TCACGCGAAA?TTCACTCTGG?AATATTCTTA?G...
【技术特征摘要】
1.一种制备丙氨酸转氨酶的方法，其特征在于，该方法包括 1)改造并全基因合成人源化丙氨酸转氨酶编码基因序列，去除大肠杆菌稀有密码子； 2)将步骤I)中改造后的丙氨酸转氨酶编码基因序列插入表达载体中，并用大肠杆菌菌株转化表达； 3)将转化表达菌株接种于LB培养基，IPTG诱导； 4)所得菌体破菌，离心分离，过N1-NTA柱纯化； 其中，步骤I)中改造后的全基因合成人源化丙氨酸转氨酶编码基因序列为2.如权利要求1所述制备丙氨酸转氨酶的方法，其特征在于，步骤2)中所述表达载体为pRSF Duet, pET表达系列。3.如权利要求1所述制备丙氨酸转氨酶的方法，其特征在于，步骤2)中所述大肠杆菌菌株为BL21 (DE3)，Rosetta (DE3)。4.如权利要求3所述制备丙...
【专利技术属性】
技术研发人员：肖飞，黄薇，张传宝，王大光，
申请(专利权)人：肖飞，
类型：发明
国别省市：
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