本发明专利技术属于分子生物学领域，涉及一种参与小麦甲羟戊酸代谢途径中类异戊二烯物质合成的分支点的关键酶基因的分离克隆、基因定点突变、酶蛋白的原核表达、酶蛋白的分离纯化及酶功能检测技术。为进一步进行基因改造和修饰、构建法呢基焦磷酸合酶基因的真核生物基因表达载体并转化相应作物，尤其是靠次生代谢获取重要商业价值的植物，探讨法呢基焦磷酸合酶基因在受体植物中的过量表达与次生代谢产物、作物籽粒大小及粒重等重要农艺性状的关系，进而提高农作物产量，以及对法呢基焦磷酸合酶基因内含子、外显子及启动子结构进行剖析，研究启动子功能、开发有关分子标记提供重要技术储备。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，涉及一种参与小麦甲羟戊酸代谢途径中类异戊二烯物质合成的分支点的关键酶基因的分离克隆、基因定点突变、酶蛋白的原核表达、酶蛋白的分离纯化及酶功能检测技术。
技术介绍
类异戊二烯物质是维持植物生长发育、光合作用、电子传递、应对环境胁迫等所必需的重要物质。该类物质可作为光合色素(如叶绿素、类胡萝卜素)、生长物质和植物激素(如细胞分裂素、脱落酸、赤霉素和油菜素内酯)、膜结构的一部分如谷留醇、电子传递受体如质体醌、作为葡萄糖基化反应中葡萄糖的受体如多萜醇，并能调控细胞的生长(如异戊烯 基蛋白，细胞分裂素)。此外，很多植物类异戊二烯还具有重要的商业价值如橡胶、食物香料、饮料、维生素A、D、E以及天然杀虫剂如除虫菊素等。类异戊二烯物质主要通过甲羟戊酸途径中的一系列酶催化合成的，其中该代谢途径中分支点的关键酶是法呢基焦磷酸合酶(FPS;EC2. 5.1. 1/EC2. 5.1. 10)，是控制整个代谢途径的限速酶之一。该酶将一个分子的异戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)通过I’-4顺序进行缩合，首先形成栊牛儿基焦磷酸(GPP)，然后与另一分子异戊烯焦磷酸缩合形成一个多分支点的、特别重要的中间产物法呢基焦磷酸(FPP)。目前已分别从拟南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryza sativa)、玉米(Zea mays)、高梁(Sorghumbicolor)、橡胶(Heveabrasiliensis)等40种植物中分离克隆了法呢基焦磷酸合酶基因，在本专利技术申请之前，还没有公开或发表过关于从小麦地方品种“玉麦”中分离克隆法呢基焦磷酸合酶基因、基因定点突变、基因原核表达、酶蛋白的分离纯化及其酶功能体外检测等研究资料信息。特别是对于野生型玉麦法呢基焦磷酸合酶基因进行定点突变的研究，现在还是空白，无法应用基因突变技术获得更好的效果。
技术实现思路
针对现有技术中在小麦法呢基焦磷酸合酶基因相关技术的缺失，本专利技术的专利技术人提供了一整套关于小麦地方品种“玉麦”法呢基焦磷酸合酶基因克隆、基因定点突变、基因原核表达、高纯度酶蛋白的分离纯化及酶功能检测技术。测得自小麦地方品种玉麦克隆获得的野生型法呢基焦磷酸合酶对底物二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)、异戊烯焦磷酸(IPP)和栊牛儿基焦磷酸(GPP)的 Vmax 分别为 10. 0±0. 6,31. 2±0. 8 和 23. 3±0. 8mol/min/mg ；KM 值分别为 O. 80±0· 12,0. 71 ±0. 04 和 O. 76±0· 06 μ M ；Kcat 分别为 O. 23±0· 01、O. 72±0· 02 和 O. 54±0· 02S-1，Kcat/KM 分别为 2. 88x105、1. 01x106 和 7. 11x105M-1S_1，由此证明克隆的野生型玉麦法呢基焦磷酸合酶基因具有天然生物学功能。测得玉麦法呢基焦磷酸合酶突变体H278L对底物二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)、异戊烯焦磷酸(IPP)和栊牛儿基焦磷酸(GPP)的 Vmax 分别为 16. 1±1· 4,46. 3±2· 8 和 41. 9±6· 3mol/min/mg ;KM 值分别为 2. 31±0· 35,1. 52±0· 19 和 2. 27±0· 62 μ M ；Kcat 分别为 O. 88±0· 08,2. 53±0· 15 和2. 29±0· 34S-1, Kcat/KM 分别为 3. 81x105、1. 66x106 和1. 01xl06M-lS_l ;测得玉麦法呢基焦磷酸合酶突变体D295E对底物二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)、异戊烯焦磷酸(IPP)和栊牛儿基焦磷酸(GPP)的 Vmax 分别为 32. 6±2· 1,76. 3±0· 8 和 70. 9±9· 5mol/min/mg ;KM 值分别为 2. 14±0· 25,0. 46±0· 02 和 2. 15±0· 51 μ M ；Kcat 分别为 2. 55±0· 16,5. 97±0· 06 和5. 54±0· 74S-1, Kcat/KM 分别为1. 19x106、1. 30x107 和 2. 58xl06M_lS_l，表明通过对氨基酸密码子的改变，能够提高酶的催化活性，其中替换的谷氨酸(E )残基对酶活性的提高较为显著。本专利技术为进一步进行基因改造和修饰、构建法呢基焦磷酸合酶基因的真核生物基因表达载体并转化相应作物，尤其是靠次生代谢获取重要商业价值的植物，探讨法呢基焦磷酸合酶基因在受体植物中的过量表达与次生代谢产物、作物籽粒大小及粒重等重要农艺性状的关系，进而提高农作物产量，以及对法呢基焦磷酸合酶基因内含子、外显子及启动子结构进行剖析，研究启动子功能、开发有关分子标记提供重要技术储备。 本专利技术提供的玉麦法呢基焦磷酸合酶基因YFPS的编码区基因序列如Seq ID No:1所示，其编码的氨基酸序列如Seq ID No:2所示。上述的玉麦中的法呢基焦磷酸合酶基因cDNA总长为1330bp，包括I个40bp的5’非编码区，I个1065bp编码区和I个225bp的3’非编码区，在1308位核苷酸处有polyA尾巴，翻译起始密码子ATG自41位核苷酸开始，终止密码子TAG位于1103位核苷酸处，编码一条包含354aa的多肽，分子量约为42kDa，其基因序列及氨基酸序列如Seq ID No:3所示；本专利技术的专利技术人提供了该基因的具体分离克隆方法、基因定点突变及其原核表达及酶功能检测的方法为1.玉麦叶片RNA的分离提取根据Trizol试剂盒的说明书进行。获得的RNA保存在DEPC水中备用。2.第一链cDNA的合成按照Takara反转录试剂盒说明书进行。3.基因中间序列扩增、连接与转化根据植物中FPS氨基酸序列的高度保守区设计基因中间序列扩增引物，扩增玉麦YFPS的相应序列。上游引物为YRF: 5’ TCAACGCCACTTCAGAGGAAAACCG3’，其基因序列如SeqID No:4 所示；下游引物为YRR:5’ TCCCGCTCATACTTGTGAAATGCCGT3’，其基因序列如 Seq IDNo:5所示。根据一定条件进行PCR，利用DNA胶回收试剂盒回收527bp特异条带。将回收的DNA片段与pGEM-T Easy载体进行连接。利用热激法转化大肠杆菌DH5 α，挑取阳性克隆，制备质粒DNA并进行DNA测序，通过NCBI比对获得目的基因片段。4.利用RACE技术快速获得基因末端序列4.1基因末端序列快速扩增利用上述获得的527bp的基因中间序列，根据Clontech Laboratories INC的SMARTTmRACE cDNA Amplification kit的方法快速扩增基因的5’和3’末端，筛选重组子，并测序。基因5’末端片段的扩增，主要利用了试剂盒提供的引物UPM(Universal PrimerA Mix)为上游引物，以扩增基因中间序列的下游引物5’ TCCCGCTCATACTTGTGAMTGCCGT3’，其基因序列如Seq ID No: 5所示的为下游引物；基因3’末端片段的扩增，利用试剂盒提供的的引物UPM(Universal Primer A Mix)为本文档来自技高网...
【技术保护点】
玉麦法呢基焦磷酸合酶基因YFPS的编码区基因序列如Seq?ID?No:1所示，其编码的氨基酸序列如Seq?ID?No:2所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：楚秀生，李永波，李玉莲，樊庆琦，黄承彦，隋新霞，郭栋，高洁，李根英，
申请(专利权)人：山东省农业科学院作物研究所，
类型：发明
国别省市：
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