利用转谷氨酰胺酶酶原生产微生物转谷氨酰胺酶的方法技术

本发明专利技术公开了利用转谷氨酰胺酶酶原生产微生物转谷氨酰胺酶的方法，包括如下步骤：（1）茂原链霉菌转谷氨酰胺酶酶原基因扩增，在酶原与成熟肽之间引入牛肠激酶的识别序列DDDDK；（2）基因克隆构建表达载体，转化大肠杆菌E.coliBL21（DE3）为工程菌E.coliBL21/proMTG，菌株保藏号为CCTCCM208240；（3）可溶性诱导表达转谷氨酰胺酶酶原；（4）亲和层析纯化蛋白，获得转谷氨酰胺酶酶原；（5）采用牛肠激酶激活酶原为成熟的转谷氨酰胺酶。本发明专利技术获得的转谷氨酰胺酶生物活性高；简化了发酵生产工艺，可以特异性完整切除转谷氨酰胺酶酶原序列，不会因非特异性切割或长时间切割导致酶的降解。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物基因工程领域，涉及转谷氨酰胺酶基因工程，特别涉及。
技术介绍
微生物转谷氨酰胺酶(microbial transglutaminase,简称MTG)是一种通过催化多肽链中酰基基团转移使蛋白质之间发生共价交联反应的转移酶。它催化蛋白分子之间发生交联反应，提高蛋白质的水溶性、持水性、塑性和热稳定性等，从而提高蛋白质的应用价值。该酶已在医药工业、食品工业和纺织工业等广泛利用，被认为是用于生产新型蛋白食品的最重要酶种，显示出显著的应用前景及优势。目前转谷氨酰胺酶的来源主要是利用从动物器官组织中提取，但是动物组织来源少、提取工艺复杂、回收率低、产品成本过于昂贵，因此该酶的生产应用一直受到很大的限制。日本 Ando 等首先报道以轮枝链霉菌属发酵生产微生物转谷氨酰胺酶。目前，主要通过以下几种方法来提高MTG的产量(I)通过诱变育种筛选高效产酶的菌株,包括传统诱变育种和太空诱变育种,如日本味之素公司就是米用经诱变的茂原链霉菌发酵生产MTG，但是这种方法获得的高产菌很容易退化，生产不稳定；王璋等将MTG生产菌搭载到“神舟四号”飞船进行育种研究，但是效果也不理想；(2)通过基因工程的本文档来自技高网...

【技术保护点】
利用转谷氨酰胺酶酶原生产微生物转谷氨酰胺酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）转谷氨酰胺酶酶原基因的扩增和引入牛肠激酶的识别序列：由茂原链霉菌转谷氨酰胺酶酶原的核苷酸序列设计PCR引物进行PCR扩增，同时利用融合PCR技术在茂原链霉菌转谷氨酰胺酶酶原与成熟肽之间引入牛肠激酶的识别序列DDDDK，获得带有牛肠激酶识别序列的表达转谷氨酰胺酶酶原的基因片段；（2）通过基因克隆构建表达载体：将步骤（1）得到的基因片段通过NdeI和XhoI双酶切，克隆到原核表达载体pET22b(+)中，构建表达载体pET22b?proMTG，并转化大肠杆菌E.coli?BL21（DE3）成为工程菌E.coli?BL...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：潘力，王坤，杨慧林，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：