本发明专利技术公开了利用转谷氨酰胺酶酶原生产微生物转谷氨酰胺酶的方法，包括如下步骤：（1）茂原链霉菌转谷氨酰胺酶酶原基因扩增，在酶原与成熟肽之间引入牛肠激酶的识别序列DDDDK；（2）基因克隆构建表达载体，转化大肠杆菌E.coliBL21（DE3）为工程菌E.coliBL21/proMTG，菌株保藏号为CCTCCM208240；（3）可溶性诱导表达转谷氨酰胺酶酶原；（4）亲和层析纯化蛋白，获得转谷氨酰胺酶酶原；（5）采用牛肠激酶激活酶原为成熟的转谷氨酰胺酶。本发明专利技术获得的转谷氨酰胺酶生物活性高；简化了发酵生产工艺，可以特异性完整切除转谷氨酰胺酶酶原序列，不会因非特异性切割或长时间切割导致酶的降解。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物基因工程领域，涉及转谷氨酰胺酶基因工程，特别涉及。
技术介绍
微生物转谷氨酰胺酶(microbial transglutaminase,简称MTG)是一种通过催化多肽链中酰基基团转移使蛋白质之间发生共价交联反应的转移酶。它催化蛋白分子之间发生交联反应，提高蛋白质的水溶性、持水性、塑性和热稳定性等，从而提高蛋白质的应用价值。该酶已在医药工业、食品工业和纺织工业等广泛利用，被认为是用于生产新型蛋白食品的最重要酶种，显示出显著的应用前景及优势。目前转谷氨酰胺酶的来源主要是利用从动物器官组织中提取，但是动物组织来源少、提取工艺复杂、回收率低、产品成本过于昂贵，因此该酶的生产应用一直受到很大的限制。日本 Ando 等首先报道以轮枝链霉菌属发酵生产微生物转谷氨酰胺酶。目前，主要通过以下几种方法来提高MTG的产量(I)通过诱变育种筛选高效产酶的菌株,包括传统诱变育种和太空诱变育种,如日本味之素公司就是米用经诱变的茂原链霉菌发酵生产MTG，但是这种方法获得的高产菌很容易退化，生产不稳定；王璋等将MTG生产菌搭载到“神舟四号”飞船进行育种研究，但是效果也不理想；(2)通过基因工程的方法构建高效表达MTG的工程菌株，如徐斌等构建了基因工程菌成功地表达了MTG，但是表达的MTG存在于包涵体中，需要经过洗涤、变性和复性等过程，并以强离子交换层析纯化，才获得了纯MTG,过程繁琐,很难实现工业化生产；Christian K等报道了可溶性生产MTG的方法，同时介绍了几种可以用来切割转谷氨酰胺酶酶原(简称proMTG)的酶，但是并没有改变proMTG的序列，而是直接筛选可以激活MTG的酶，这些酶除分散酶dispase外特异性都不强，dispase虽然具有较强的特异性，但是其效率不高，而且激活后的MTG在N端还带有酶原的4个氨基酸残基；杨慧林等，中国专利 200810220160. I公开了一种大肠杆菌及其可溶性表达转谷氨酰胺酶酶原的方法，先进行高密度发酵，并采用纯化柱上激活的方式生产MTG，但是其使用的激活剂是胰蛋白酶，特异性不强，在将酶原序列切除后会继续切割proMTG，从而导致MTG的降解。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种。本专利技术首先构建一株工程菌，菌株保藏编号为CCTCC M208240，通过低温发酵的方法实现了可溶性表达转谷氨酰胺酶酶原，然后用牛肠激酶(简称EK)激活后获得成熟的转谷氨酰胺酶。为了达到上述目的，本专利技术采用了如下技术方案 ，包括如下步骤 (1)转谷氨酰胺酶酶原基因的扩增和引入牛肠激酶的识别序列由茂原链霉菌转谷氨酰胺酶酶原的核苷酸序列设计PCR引物进行PCR扩增，同时利用融合PCR技术在茂原链霉菌转谷氨酰胺酶酶原与成熟肽之间引入牛肠激酶的识别序列DDDDK，获得带有牛肠激酶识别序列的表达转谷氨酰胺酶酶原的基因片段； (2)通过基因克隆构建表达载体将步骤(I)得到的基因片段通过MfcI和通ol双酶切，克隆到原核表达载体pET22b (+)中，构建表达载体pET22b-pix)MTG，并转化大肠杆菌E.coli BL21 (DE3)成为工程菌 E. coli BL21/proMTG，该菌株保藏编号为 CCTCC M208240 ； (3)可溶性表达转谷氨酰胺酶酶原将步骤(2)得到的工程菌E.coli BL21/proMTG先活化培养，然后接种到新鲜的培养基中，发酵生长后降低温度到22 24°C，然后加入异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷诱导表达，诱导表达后收集菌体； (4)蛋白纯化工艺对步骤(3)收集的菌体用超声破碎裂解细胞后离心，上清液用亲和层析柱纯化蛋白，用500 μ mol/L的咪唑洗脱目的蛋白，获得转谷氨酰胺酶酶原蛋白； (5)转谷氨酰胺酶酶原的激活采用牛肠激酶作为激活剂，将表达的转谷氨酰胺酶酶原激活为成熟的转谷氨酰胺酶。所述转谷氨酰胺酶酶原在酶原与成熟酶之间带有牛肠激酶的切割位点，切割位点的引入位置为以下三种方式直接将成熟肽的前五个氨基酸改为DDDDK ;在成熟肽与酶原之间插入DDDDK ;将酶原序列的最后五个氨基酸改为DDDDK。步骤(3)中，所述活化培养的培养基为LB培养基，温度为37°C，时间为12 14h ;所述接种的接种量为广2% (ν/ν);所述发酵生长的培养基为LB培养基，温度为37°C，时间为2 3h ；。步骤(3)中，所述异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷的溶度为O. 8^1. OmM，所述诱导表达的时间为8 10h。步骤(5)中，所述牛肠激酶为大肠杆菌或毕赤酵母生产的商品化酶。步骤(5)中，所述牛肠激酶的浓度为5U/y L，加入体积为酶原体积的l/5(Tl/25 ；所述激活的温度为4 37°C，时间为4h。步骤(5)中，牛肠激酶的切割位点的引入位置优选为在成熟肽和酶原之间插入DDDDK。本专利技术步骤(2)构建的工程菌E. coli BL21/proMTG已于2008年11月25日保藏于中国典型培养物保减中心(简称CCTCC，地址为武汉市武昌洛咖山，中国武汉大学，中国典型培养物保藏中心)，保藏编号为CCTCC M208240。本专利技术与现有技术相比，具有如下优点 (1)本专利技术在茂原链霉菌转谷氨酰胺酶酶原与成熟肽之间引入牛肠激酶的识别序列，然后用牛肠激酶激活转谷氨酰胺酶酶原，成功地获得了具有活性的转谷氨酰胺酶，由于牛肠激酶具有专一性的识别位点，避免了其他酶作为激活剂时因特异性不强而导致酶的降解； (2)本专利技术简化了发酵生产工艺，避免了因切 割时间过长导致酶的降解； (3)通过本专利技术的方法获得的转谷氨酰胺酶的活性较高，纯化效果好。附图说明图I为融合PCR方法扩增带有EK识别序列的proMTG片段图。图2为proMTG纯化及经EK切割后的聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称SDS_PAGE)图。图3为纯化后的proMTG经EK分别切割24h、96h后的SDS-PAGE图。具体实施例方式下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步说明，但本专利技术要求保护的范围并不限于此。实施例I (1)转谷氨酰胺酶酶原基因的扩增和引入牛肠激酶的识别序列从美国国立生物技术信息中心(简称NCBI)中获得茂原链霉菌转谷氨酰胺酶酶原的核苷酸序列，茂原链霉菌基因组DNA为PCR反应模板，引物为SEQ ID No4、SEQID No5、SEQ ID No6、SEQ ID No7，将成熟肽的最前面的五个氨基酸DSDDR改为DDDDK，扩增出与转谷氨酰胺酶酶原基因大小相符的DNA片段，如图I所示，M为Marker，1、2为本实施例将成熟肽最前面的五个氨基酸DSDDR改为DDDDK时的PCR产物，带有EK切割位点的转谷氨酰胺酶酶原基因片段的序列见序列表SEQ ID Nol ； (2)通过基因克隆构建表达载体将步骤(I)得到的带有EK切割位点的基因片段通过Ndel和ZAoI双酶切，克隆到原核表达载体pET22b(+)中，构建表达载体pET22b_proMTG，并转化大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)成为工程菌E. coli BL21/proMTG ； (3)可溶性表达转谷氨酰胺酶酶原将步骤(2)得到的工程菌E.coli BL21/proMTG单菌落接种到IOmL新鲜的L本文档来自技高网...
【技术保护点】
利用转谷氨酰胺酶酶原生产微生物转谷氨酰胺酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）转谷氨酰胺酶酶原基因的扩增和引入牛肠激酶的识别序列：由茂原链霉菌转谷氨酰胺酶酶原的核苷酸序列设计PCR引物进行PCR扩增，同时利用融合PCR技术在茂原链霉菌转谷氨酰胺酶酶原与成熟肽之间引入牛肠激酶的识别序列DDDDK，获得带有牛肠激酶识别序列的表达转谷氨酰胺酶酶原的基因片段；（2）通过基因克隆构建表达载体：将步骤（1）得到的基因片段通过NdeI和XhoI双酶切，克隆到原核表达载体pET22b(+)中，构建表达载体pET22b?proMTG，并转化大肠杆菌E.coli?BL21（DE3）成为工程菌E.coli?BL21/proMTG，该菌株保藏编号为CCTCC?M208240；（3）可溶性表达转谷氨酰胺酶酶原：将步骤（2）得到的工程菌E.coli?BL21/proMTG先活化培养，然后接种到新鲜的培养基中，发酵生长后降低温度到22~24℃，然后加入异丙基?β?D?硫代吡喃半乳糖苷诱导表达，诱导表达后收集菌体；（4）蛋白纯化工艺：对步骤（3）收集的菌体用超声破碎裂解细胞后离心，上清液用亲和层析柱纯化蛋白，用500μmol/L的咪唑洗脱目的蛋白，获得转谷氨酰胺酶酶原蛋白；（5）转谷氨酰胺酶酶原的激活：采用牛肠激酶作为激活剂，将表达的转谷氨酰胺酶酶原激活为成熟的转谷氨酰胺酶。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：潘力，王坤，杨慧林，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：
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