来源于微生物的转谷氨酰胺酶的修饰方法技术

本发明专利技术涉及以来源于茂原链轮丝菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍｍｏｂａｒａｅｎｓｅ）的转谷氨酰胺酶（ＭＴＧ）的立体结构为基础，设计、制作变异型ＭＴＧ的方法，以及制作的变异型ＭＴＧ。按照本发明专利技术，可以提供以立体结构为基础改变ＭＴＧ的方法，以及据此改良了对基质的反应性的转谷氨酰胺酶。在本发明专利技术的方法中，以对ＭＴＧ的晶体进行Ｘ射线晶体结构解析得到的立体结构为基础，推测ＭＴＧ与基质的结合部位，通过位于转谷氨酰胺酶的基质结合部位的氨基酸残基的置换、插入、缺失来设计、制作变异型转谷氨酰胺酶。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

技术介绍
本专利技术涉及以采用X射线晶体结构解析技术确定的来源于茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)的转谷氨酰胺酶(以下简称为MTG)的立体结构为基础，设计、制作变异型MTG的方法，以及制作的变异型MTG。MTG通过使蛋白质之间形成交联键，生成凝胶状物质，因此广泛用于食品加工等领域。提高了转谷氨酰胺酶活性和热稳定性的变异型MTG有助于减少必要量，改变了基质特异性和最适pH的变异型MTG有可能将该酶适用于新的领域。转谷氨酰胺酶是催化蛋白质的肽链内具有的γ-羧基酰胺基的酰基转移反应的酶。如果使该酶对蛋白质作用，则发生形成ε-(γ-Glu)-Lys交联的反应、Gln由于脱酰胺化转变成Glu的取代反应。转谷氨酰胺酶迄今为止已知来源于动物的转谷氨酰胺酶和来源于微生物的转谷氨酰胺酶。前者是Ca2+依赖性的酶，分布在动物的脏器、皮肤、血液等中。例如，土拨鼠肝脏转谷氨酰胺酶〔K.Ikura等，生物化学(K.Ikura et al Biochemistry)，第27卷，第2898页(1988)〕、人表皮角蛋白细胞转谷氨酰胺酶〔M.A.Phillips等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，第87卷，第9333页(1990)〕、人血液凝固因子XIII〔A.Ichinose等，生物化学，第25卷，第6900页(1990)〕等。至于后者，由链轮丝菌属的细菌发现了Ca2+非依赖性的转谷氨酰胺酶。例如灰肉色链轮丝菌(Streptoverticillium griseocarneum)IFO12776、肉桂链轮丝菌肉桂亚种(Streptoverticillium cinnamoneumsub sp.cinnamoneum)IFO 12852、茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)IFO 13819等。其中，将由茂原链轮丝菌的变种(variant)的培养上清液发现的转谷氨酰胺酶称为MTG(Microbial Transglutaminase)。而且，由利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)NRRL B-3446也发现了Ca2+非依赖性的转谷氨酰胺酶(特表平10-504721号)。MTG是由331个氨基酸构成的分子量约38000的单体蛋白质〔Journal of Biological Chemistry，第268卷，第11565页(1993)〕。也报道了由大肠杆菌(E.coli)、酵母等分泌表达的方法(特开平5-199883号)，或者在大肠杆菌中将MTG作为蛋白质包含体表达后，用蛋白质变性剂对该包含体进行增溶，经过脱变性剂处理使之再生，生产具有活性的MTG的方法(特开平6-30771号)。与来源于动物的转谷氨酰胺酶不同，以MTG为首的来源于微生物的转谷氨酰胺酶是Ca2+非依赖性的，因此可以用于果冻等凝胶化食品、酸乳酪、干酪或凝胶状化妆品等的制造或者食用肉的肉质改善等(特开昭64-27471号)。另外，也用于制造对热稳定的微胶囊的材料、固定化酶的载体等，是工业实用性高的酶。关于酶反应条件，例如在凝胶化食品的场合，如果酶反应时间短则不凝固，相反如果反应时间过长，则变得过硬，不能成为商品。因此，在果冻等凝胶化食品、酸乳酪、干酪或凝胶状化妆品等的制造中或者食用肉的肉质改善等中利用MTG时，通过调节基质以及酶的浓度、反应温度、反应时间，制作目的产物。但是，利用MTG的食品或试剂等覆盖很多方面，有时仅仅通过调节浓度、温度、时间等，不能制作所需的产品，从而产生了对MTG的酶活性进行改性的必要性。为了对MTG的酶活性进行改性，有必要制作MTG的变异体，评价其活性、基质特异性等，探索出优良的变异体。制作变异体时，有必要操纵野生型的基因，因此能够制备基因重组型蛋白质成为了必要条件。MTG的场合，确立了使用大肠杆菌的大量表达体系(特开平6-30771号)。但是，用大肠杆菌大量表达的MTG作为不溶性的蛋白质包含体蓄积在菌体内。蛋白质包含体中变性的MTG必须在增溶后重折叠使之具有活性，因而制作一个变异型MTG必须要有2～3周的时间。因此，期望有一种方法，能够采用某种手段合理地修饰MTG，而不是对分子全体随机地引入变异。专利技术公开本专利技术的目的之一在于提供一种改良MTG的方法。另外，本专利技术的另一目的在于提供改良了对基质的反应性的转谷氨酰胺酶。本专利技术人为了解决上述课题进行了悉心研究，结果发现以立体结构为基础能够制作改良了对基质的反应性的转谷氨酰胺酶，从而完成了本专利技术。概括来说，本专利技术可以例举如下。(1)一种设计、制作变异型转谷氨酰胺酶的方法，以对MTG进行X射线晶体结构解析得到的立体结构为基础，推测MTG与基质的结合部位，通过位于转谷氨酰胺酶的基质结合部位的氨基酸残基的置换、插入、缺失来设计、制作变异型转谷氨酰胺酶。(2)一种改变了基质特异性的变异型MTG，序列表中序列号2所示的MTG氨基酸序列的以下位置(活性残基Cys64至20_以内，暴露于与酰基受体的推测结合部位表面的残基)1-5、26、28、58-59、62、69、74-75、77、79、235-236、238-244、248-250、252-254、277-278、282-287、289、291、296-297、300-304中至少1个位置发生变化。(3)一种改变了基质特异性的变异型转谷氨酰胺酶，该酶是具有转谷氨酰胺酶活性的酶，与MTG进行氨基酸序列对比时，与序列表中序列号2所示的MTG氨基酸序列的以下位置(活性残基Cys64至20_以内，暴露于与酰基受体的推测结合部位表面的残基)1-5、26、28、58-59、62、69、74-75、77、79、235-236、238-244、248-250、252-254、277-278、282-287、289、291、296-297、300-304相对应的至少1个位置发生变化。(4)一种改变了基质特异性的变异型转谷氨酰胺酶，该酶是具有转谷氨酰胺酶活性的酶，采用Treading法与MTG的3维结构进行序列对比时，与序列表中序列号2所示的MTG氨基酸序列的以下位置(活性残基Cys64至20_以内，暴露于与酰基受体的推测结合部位表面的残基)1-5、26、28、58-59、62、69、74-75、77、79、235-236、238-244、248-250、252-254、277-278、282-287、289、291、296-297、300-304相对应的至少1个位置发生变化。(5)一种改变了基质特异性的变异型MTG或变异型转谷氨酰胺酶，通过改变(2)～(4)中任意一项所述的氨基酸序列的位置上存在的酸性氨基酸残基或与该酸性氨基酸残基接近的氨基酸残基，缓和负电荷，从而改变基质特异性。(6)一种基因，编码(2)项～(5)项中任意一项所述的变异型MTG或变异型转谷氨酰胺酶。(7)一种重组DNA，包含(6)项所述的基因。(8)一种微生物，具有(harboring)(7)项所述的重组DNA。(9)一种制造变异型MTG或变异型转谷氨酰胺酶的方法，其特征在于培养(8)项所述的微生物，采集变异型MTG或变异型转谷氨酰胺酶。(10)一种MTG的晶体，具有单斜晶系的空间群P21。也本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种设计、制作变异型转谷氨酰胺酶的方法，以对来源于茂原链轮丝菌的转谷氨酰胺酶（简称为ＭＴＧ）进行Ｘ射线晶体结构解析得到的立体结构为基础，推测ＭＴＧ与基质的结合部位，通过位于转谷氨酰胺酶的基质结合部位的氨基酸残基的置换、插入、缺失来设计、制作变异型转谷氨酰胺酶。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：柏木立己，榛叶信久，石川弘纪，铃木荣一郎，平山和雄，横山敬一，
申请(专利权)人：味之素株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]