丙氨酰谷氨酰胺注射液中一个四肽类杂质的分离制备方法技术

本发明专利技术公开了一种丙氨酰谷氨酰胺注射液中一个四肽类微量杂质的分离制备方法，包括以下步骤：1)、采用制备型高效液相色谱法对丙氨酰谷氨酰胺注射液中的四肽杂质进行预分离：高效液相色谱法以氨丙基键合硅胶为固定相，以乙腈‑甲酸铵缓冲液为流动相进行等度洗脱；该四肽类微量杂质的分子式为C16H27N5O8；2)、采用制备型高效液相色谱法对步骤1)所得到的四肽杂质粗品进行精制纯化：高效液相色谱法以氨丙基键合硅胶为固定相，以乙腈‑甲酸缓冲液为流动相进行等度洗脱；收集、合并目标馏分并冷冻干燥，得到纯化的四肽类杂质。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于药物杂质研究
，具体涉及丙氨酰谷氨酰胺注射液中的一个四肽类微量杂质的分离制备方法。
技术介绍
化学药物在临床使用中会产生一些不良反应，这个不良反应除了与药品本身的药理活性有关外，与药品中存在的杂质也有很大关系。因此，对于化学药品各个国家药典均在附录中设有专门的杂质检验通则，中国药典二部从(2005)开始附录中设有药物杂质研究指导原则，国家食品药品监督管理局也发布了《化学药物杂质研究的技术指导原则》。针对药物中的杂质，必须依据其生理活性制定其质控限度，其中包括：药品中的杂质被有效的分离，从而保证药品质量，减少药物的不良反应。药物杂质的分离制备是药物研究中最为关键的技术之一。中国药典(2015年版)明确规定，丙氨酰谷氨酰胺注射液中单个未知杂质的含量不得超过0.5％。由于丙氨酰谷氨酰胺分子结构的特殊性，在高温灭菌过程中易引入类似结构副产物，由于其化学结构的相似性，传统的分离方法如萃取、重结晶、蒸馏和TLC都很难将其分离。分析型的HPLC只能获得微克级的产物，为了获得高品质的丙氨酰谷氨酰胺注射液，需提取其主要杂质并进行结构确证。已经公开发表于《JournalofChromatographyA》的“Quantitativehigh-performanceliquidchromatography–tandemmassspectrometryimpurityprofilingmethodsfortheanalysisofarenteralinfusionsolutionsforaminoacidsupplementationcontainingl-alanyl-l-glutamine”(2012,1259,111-120)一文中告知了一种四肽类微量杂质，其分子量为417.2Da，分子式为C16H27N5O8，氨基酸序列为：L-Ala-L-Glu-(L-Ala-L-Gln)，化学结构式如(I)所示：
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种丙氨酰谷氨酰胺注射液中分离制备四肽类微量杂质的方法；以便于对丙氨酰谷氨酰胺注射液系列产品进行质量控制。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种丙氨酰谷氨酰胺注射液中一个四肽类微量杂质的分离制备方法，包括以下步骤：1)、采用高效液相色谱法(制备型高效液相色谱法)对丙氨酰谷氨酰胺注射液中的四肽杂质进行预分离：所述高效液相色谱法以氨丙基键合硅胶为固定相，以乙腈-甲酸铵缓冲液为流动相进行等度洗脱；该四肽类微量杂质的分子式为C16H27N5O8；通过紫外检测器的在线监测，收集、合并目标馏分并冷冻干燥，得四肽杂质粗品；2)、采用高效液相色谱法(制备型高效液相色谱法)对步骤1)所得到的四肽杂质粗品进行精制纯化：所述高效液相色谱法以氨丙基键合硅胶为固定相，以乙腈-甲酸缓冲液为流动相进行等度洗脱；通过紫外检测器的在线监测，收集、合并目标馏分并冷冻干燥，得到纯化的四肽类杂质。作为本专利技术的四肽类微量杂质的分离制备方法的改进：所述步骤1)中：甲酸铵缓冲液为甲酸铵水溶液，甲酸铵浓度为10mM～20mM；氨丙基键合硅胶的粒径为20～30μm；流动相中，乙腈的体积含量均为30％～60％(较佳为40％)；流动相的pH值均为3.0～4.5(较佳为4)。所述步骤2)中：甲酸缓冲液为甲酸水溶液，甲酸体积浓度为0.1～0.2％；氨丙基键合硅胶的粒径≤7μm；流动相中，乙腈的体积含量均为30％～60％(较佳为50％)。在本专利技术中，步骤1)的洗脱流速为40～60ml/min(较佳为50ml/min)；步骤2)的洗脱流速为8～12ml/min(较佳为10ml/min)。在本专利技术中，步骤1)和步骤2)所用的氨丙基键合硅胶均可通过常规市购方式获得，例如：步骤1)所用的氨丙基键合硅胶可购自日本YMC公司生产的NHG12S21的氨丙基键合硅胶；步骤2)所用的氨丙基键合硅胶可购自日本YMC公司生产的NH12S05-2520WT的氨丙基键合硅胶。本专利技术所述的丙氨酰谷氨酰胺注射液中的四肽类微量杂质，其分子量为417.2Da，分子式为C16H27N5O8，氨基酸序列为：L-Ala-L-Glu-(L-Ala-L-Gln)，化学结构式如上述(I)所示。本专利技术通过制备型高效液相色谱方法将丙氨酰谷氨酰胺注射液中的一个含量仅为0.3％的四肽类微量杂质进行高效分离与制备，并采用高分辨质谱(HRMS)、一维及二维核磁共振谱(1D/2D-NMR)对该杂质的化学结构式进行结构鉴定，最终确证其分子式及化学结构。采用本专利技术的方法能获得高纯度的四肽类微量杂质。本专利技术为生产丙氨酰谷氨酰胺注射液系列产品的质量研究及杂质定性、定量控制提供了较好的杂质对照品，可以为申报临床用药制定杂质限量提供可靠依据。附图说明下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细说明。图1是丙氨酰谷氨酰胺注射液中四肽类微量杂质的结构图；图2是丙氨酰谷氨酰胺注射液中四肽类微量杂质的色谱图；图3是丙氨酰谷氨酰胺注射液中四肽类微量杂质的高分辨质谱图；图4是丙氨酰谷氨酰胺注射液中四肽类微量杂质的核磁共振氢谱图；图5是丙氨酰谷氨酰胺注射液中四肽类微量杂质的核磁共振碳谱图；图6是丙氨酰谷氨酰胺注射液中四肽类微量杂质的核磁共振DEPT135°谱图；图7是丙氨酰谷氨酰胺注射液中四肽类微量杂质的二维核磁共振(1H-1HCOSY)谱图；图8是丙氨酰谷氨酰胺注射液中四肽类微量杂质的二维核磁共振(HSQC)谱图；图9是丙氨酰谷氨酰胺注射液中四肽类微量杂质的核磁共振二维(HMBC)谱图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此。实施例1、丙氨酰谷氨酰胺注射液中一个四肽类微量杂质的预分离：将丙氨酰谷氨酰胺注射液冻干粉400.0g用500ml蒸馏水溶解，过滤(过0.45μm孔径的滤膜)，收集滤液备用。制备色谱分离条件为：高效液相色谱仪型号：汉邦NP7010色谱柱：50×250mm，内装满氨丙基键合硅胶为固定相填料，该填料粒径为20μm，孔径为流速：50ml/min。检测波长：215nm。流动相：乙腈-甲酸铵缓冲液(体积比为40:60，其中甲酸铵缓冲液中的甲酸铵浓度为20mmol/l，并用甲酸调节至pH值为4.0)。洗脱方式：等度洗脱。上样量：40.0g(50ml)。纯化过程：使色谱柱平衡15分钟后上样并进行等度洗脱，监测并分段收集馏分，对所收集的馏分进行检测(下述药典方法，按面积归一化法进行测定)，将目的峰馏分合并、除去乙腈后冻干，待后续精制分离。分十次进样(即，每次上样量为4g)，重复以上操作，共获得四肽杂质粗品4.0g，HPLC检测纯度为60.02％(面积归一化法，按照中国药典2015年版通则0512进行测定，以下同)。备注说明：洗脱时间共计50分钟，收集第36～41分钟的洗脱液，从而实现将目的峰馏分合并。实施例2、丙氨酰谷氨酰胺注射液中四肽类的杂质的精制分离将实施例1中的四肽杂质粗品4.0g用50ml蒸馏水溶解，过滤(过0.45μm孔径的滤膜)，收集滤液备用。制备色谱精制分离条件：高效液相色谱仪型号：Waters600色谱柱：20×250mm，内装满氨丙基键合硅胶为固定相填料，该填料粒径为5μm，孔径为流速：10ml/min。检测波本文档来自技高网...

【技术保护点】
丙氨酰谷氨酰胺注射液中一个四肽类微量杂质的分离制备方法，其特征是包括以下步骤：1)、采用高效液相色谱法对丙氨酰谷氨酰胺注射液中的四肽杂质进行预分离：所述高效液相色谱法以氨丙基键合硅胶为固定相，以乙腈‑甲酸铵缓冲液为流动相进行等度洗脱；该四肽类微量杂质的分子式为C16H27N5O8；通过紫外检测器的在线监测，收集、合并目标馏分并冷冻干燥，得四肽杂质粗品；2)、采用高效液相色谱法对步骤1)所得到的四肽杂质粗品进行精制纯化：所述高效液相色谱法以氨丙基键合硅胶为固定相，以乙腈‑甲酸缓冲液为流动相进行等度洗脱；通过紫外检测器的在线监测，收集、合并目标馏分并冷冻干燥，得到纯化的四肽类杂质。

【技术特征摘要】
1.丙氨酰谷氨酰胺注射液中一个四肽类微量杂质的分离制备方法，其特征是包括以下步骤：1)、采用高效液相色谱法对丙氨酰谷氨酰胺注射液中的四肽杂质进行预分离：所述高效液相色谱法以氨丙基键合硅胶为固定相，以乙腈-甲酸铵缓冲液为流动相进行等度洗脱；该四肽类微量杂质的分子式为C16H27N5O8；通过紫外检测器的在线监测，收集、合并目标馏分并冷冻干燥，得四肽杂质粗品；2)、采用高效液相色谱法对步骤1)所得到的四肽杂质粗品进行精制纯化：所述高效液相色谱法以氨丙基键合硅胶为固定相，以乙腈-甲酸缓冲液为流动相进行等度洗脱；通过紫外检测器的在线监测，收集、合并目标馏分并冷冻干燥，得到纯化的四肽类杂质。2.根据权利要求1所述的四肽类微量杂质的分离制备方法，其特征是：所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：柯云翠，朱义，周娜，
申请(专利权)人：杭州民生药业有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33