一种抗结核病药物高通量筛选模型的构建方法技术

本发明专利技术提供了一种抗结核病药物高通量筛选模型的构建方法，其是以内源性表达ESX-1分泌系统的海分枝杆菌为模式生物，选择ESX-1分泌系统中C末端带有信号肽的重要的毒力因子CFP-10蛋白与荧光素酶融合，构建外源表达CFP-10和荧光素酶融合蛋白的重组海分枝杆菌，向含有该重组菌的培养液中加入待筛选的药物化合物，培养一定时间后取上清进行荧光素酶活性测定，以此来评价药物对ESX-1分泌系统的抑制活性；同时，通过测定A600来监测海分枝杆菌的生长状况。将此分析方法发展成高通量药物筛选模型，筛选ESX-1分泌系统抑制剂，获得既能降低结核分枝杆菌的致病性又不抑制其体外生长，即不易诱发耐药的新型抗结核活性化合物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及药物高通量筛选模型的构建方法，具体地说，涉及。
技术介绍
结核病是ー种死亡率较高的感染性疾病，严重威胁着人类健康。全球约有三分之一的人感染了结核分枝杆菌，现有结核病人约2000万，毎年新发生约900万病人，死亡人数高达300万。我国作为22个结核病的高发国家之一，结核病人数仅次于印度，位居世界第ニ，毎年死于结核病的人约25万之多，是各类传染病死亡人数总和的两倍多。此外，感染了HIV的结核分枝杆菌携帯者，由于病毒破坏了机体的免疫功能，发展为活动性结核病的可能 性比未感染HIV者高30 50倍，且结核的病程发展更快，更易致死。结核病加重了 HIV感染者或艾滋病人的疾病负担，成为威胁人类健康的全球性公共卫生问题。由于耐药及耐多药结核分枝杆菌的出现，发展新型抗结核药物，特别是抗耐药结核药物成为研究的重点，寻找抑制细菌生长的活性化合物是目前抗结核药物研发的主要思路。现有的抗结核的一线药物主要有利福平、异烟肼、こ胺丁醇、链霉素和吡嗪酰胺等，这些药物多数是通过抑制结核分枝杆菌细胞壁合成或蛋白合成等细菌生存所必需的环节，直接抑制细菌的生长或者杀死细菌。在药物产生的生存压カ下，结核分枝杆菌通过突变作用靶点、增加药物的外排、产生钝化酶、改变膜的通透性等各种途径，使原有的抗结核药物逐渐失去效力，导致耐药性的产生。据世界卫生组织最新报告显示，全球范围内几种抗结核一线药物的平均耐药率依次为链霉素出.3%)、异烟肼(5.6%)、利福平(1.4%)、こ胺丁醇(0.8% )。所以，尽管具有新作用机制的药物可以有效抑制这些耐药菌的生长，但如何从根本上解决“药物-耐药-新药-耐新药”这ー循环性耐药性问题，成为目前抗结核药物研发的关键之一。本专利技术选择结核分枝杆菌生长非必需但与其致病性密切相关的ESX-I分泌系统为药物靶点，探索利用低药物选择性的毒力因子为靶点发展抗结核药物的新策略，突破以抑制结核分枝杆菌生长为目标的传统药物研发思路，发展低药物选择压カ的致病性抑制齐U，解决目前日趋严重的结核杆菌耐药问题。致病细菌将其毒力因子分泌到胞外，可以促进细菌在宿主体内的繁殖和扩散并产生致病性。研究表明结核分枝杆菌的ESX-I分泌系统(VII型分泌系统)介导多种毒力因子的分泌，在结核杆菌的致病性中起着关键作用。ESX-I分泌系统在结核分枝杆菌的早期感染中发挥着重要的作用，參与结核分枝杆菌与宿主细胞早期的结合，引起细胞溶解，促进肉芽肿的形成，抑制吞噬体成熟，同时能够调节宿主细胞的相关免疫反应，对减少感染的巨噬细胞的细胞因子分泌反应起重要作用。ESX-I分泌系统主要由RDl (region of differenceI)区编码。该基因区在非致病性结核分枝杆菌和BCG疫苗株中是缺失的。RDl区包括9个基因(Rv3871 Rv3879c)，是结核分枝杆菌重要的毒力因子。ESAT_6(early secretedantigenic target of 6kD, Rv3875)和 CFP-10 (culture filtrate protein of IOkD,Rv3874)是最先被发现的两个由ESX-I分泌系统分泌的蛋白。这两种蛋白能够形成I : I的ニ聚体结构来发挥毒カ效应。ESAT-6是ESX-I分泌系统中ー个重要的效应分子，当改变ESAT-6蛋白的个别氨基酸时不会抑制ESAT-6的分泌，但是会导致重组结核分枝杆菌毒力的减弱。CFP-IO和ESAT-6的协同分泌是分枝杆菌在巨噬细胞中増殖和抑制吞噬体成熟所必需的，其中C端起着重要的作用。CFP-10的C端具有信号序列能够和细胞质蛋白Rv3871结合，信号序列位点的突变能够阻止ESAT-6和CFP-10的分泌。Rv3869、Rv3870和Rv3877分别有1、3和11个转膜位点，这3种蛋白同ESX-I分泌系统的Rv3871共同形成一个膜结合的ESX-I分泌复合体，通过ATP的水解转运分泌蛋白。研究表明，Rv3870、Rv3871和Rv3877的突变株对巨噬细胞的毒カ减弱，并且在巨噬细胞的感染过程中引发弱化的免疫反应。如果将完整的RD-I区整合入BCG菌株后，ESAT-6蛋白的ESX-I分泌系统依赖性分泌能够恢复。这些均表明ESX-I分泌系统是结核分枝杆菌关键的致病因素。
技术实现思路
本专利技术的目的是以结核分枝杆菌生长非必需但与其致病性密切相关的ESX-I分泌系统为药物靶点，提供。 为了实现本专利技术目的，本专利技术的，其是通过构建外源表达来自于结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)中的CFP-10蛋白和报告蛋白的融合蛋白的重组海分枝杆菌，以该重组菌作为针对ESX-I分泌系统的抗结核病药物高通量筛选模型，向含有该重组菌的培养液中加入待筛选的药物化合物，培养一段时间后离心取上清測定报告蛋白的表达量或活性，以此来评价该药物化合物对ESX-I分泌系统的抑制活性。其中，所述报告蛋白为荧光素酶、氯霉素こ酰基转移酶、￠-半乳糖苷酶、分泌型碱性磷酸酶或荧光蛋白家族中的成员，优选荧光素酶。本专利技术还提供含有CFP-10蛋白和荧光素酶的融合蛋白以及编码该融合蛋白的基因。本专利技术还提供含有上述基因的载体。优选地，其出发载体为PMV261。本专利技术还提供含有上述载体的宿主细胞。优选地，其为海分枝杆菌(Mycooacterium marinum)。本专利技术进一歩提供上述融合蛋白、编码所述融合蛋白的基因、含有该基因的载体以及含有该载体的宿主细胞在筛选抗结核病药物中的应用。相对于结核分枝杆菌而言，海分枝杆菌生长速度相对较快，存在ESX-I分泌系统且生物安全性较高，目前已广泛用于结核病发病机制的研究。以内源性表达ESX-I分泌系统的海分枝杆菌为模式生物，选择ESX-I分泌系统中C末端带有信号肽的重要的毒力因子CFP-10蛋白与荧光素酶(Luciferase简称LUC)融合，构建外源表达CFP-10和荧光素酶融合蛋白的重组海分枝杆菌，向含有该重组菌的培养液中加入待筛选的药物化合物，培养ー定时间后取上清进行荧光素酶活性測定，以此来评价药物对ESX-I分泌系统的抑制活性；同时，通过测定A6tltl来监测海分枝杆菌的生长状況。将此分析方法发展成高通量药物筛选模型，筛选ESX-I分泌系统抑制剂，获得既能降低结核分枝杆菌的致病性又不抑制其体外生长，即不易诱发耐药的新型抗结核活性化合物。附图说明图I为本专利技术重组质粒pMV261-LUC-CFP-10的结构示意图。图2为反义DNA对重组海分枝杆菌MM-pMV261-LUC-CFP-10分泌活性的影响。图3为重组海分枝杆菌发酵液上清与荧光值的量效关系曲线。图4为荧光值分析结果的重复性实验。具体实施例方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。以下实施中使用的质粒pMV261已在C. K. Stover等，New use of BCGfor recombinant vaccines. Nature 1991,351 :456-460 中公开，该质粒由法国UniversiteMontpellier II Laurent 博士惠赠。·实施例I抗结核病药物高通量筛选模型的构建流程I. I 质粒 pMV261-LUC-CFP-10 的构建以质粒pGL4 (购自 Promeg本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗结核病药物高通量筛选模型的构建方法，其特征在于，其是通过构建外源表达来自于结核分枝杆菌(Mycobacterium？tuberculosis)中的CFP？10蛋白和报告蛋白的融合蛋白的重组海分枝杆菌，以该重组菌作为针对ESX？1分泌系统的抗结核病药物高通量筛选模型，向含有该重组菌的培养液中加入待筛选的药物化合物，培养一段时间后离心取上清测定报告蛋白的表达量或活性，以此来评价该药物化合物对ESX？1分泌系统的抑制活性。

【技术特征摘要】
1.一种抗结核病药物高通量筛选模型的构建方法，其特征在于，其是通过构建外源表达来自于结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)中的CFP-10蛋白和报告蛋白的融合蛋白的重组海分枝杆菌，以该重组菌作为针对ESX-I分泌系统的抗结核病药物高通量筛选模型，向含有该重组菌的培养液中加入待筛选的药物化合物，培养一段时间后离心取上清測定报告蛋白的表达量或活性，以此来评价该药物化合物对ESX-I分泌系统的抑制活性。2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述报告蛋白为荧光素酶、氯霉素こ酰基转移酶、3 -半乳糖苷酶、分泌型碱性磷酸酶或荧...

【专利技术属性】
技术研发人员：岑山，贾平平，张义，李晓宇，周金明，殷霄，
申请(专利权)人：中国医学科学院医药生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：