一种葡萄酒酿造用微生物的高通量筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种葡萄酒酿造用微生物的高通量筛选方法，该方法利用高通量筛选设备，先在选择性固体培养基上对具有特定菌落形态或酿造特性的菌株进行初筛，再利用微孔板对初筛得到的菌株进行微型发酵复筛，将复筛得到的菌株进行微型发酵，然后将得到的发酵液进行代谢物分析和多元统计分析，对复筛得到的菌株进行代谢框架归集分组，将不同归集分组的菌株进行小试发酵，并利用理化检测和感官评定确定适合作为葡萄酒酿造用微生物的菌株。本发明专利技术方法能够快速、准确而简便地筛选出适合特定产地、特定葡萄品种或特定酿造需求的葡萄酒酿造用微生物，从而大大降低实验工作量，节约70%以上的人力，并将研发周期从1-3年降低至4-6个月。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及葡萄酒酿造领域，具体地，涉及一种葡萄酒酿造用微生物的高通量筛选方法。
技术介绍
葡萄酒是指以新鲜葡萄或葡萄汁为原料，人工或天然接种酵母菌后，将糖全部或部分发酵转化成乙醇的饮料酒。葡萄酒酿造是一个复杂的微生物学过程，其中酵母菌是占主导地位的微生物。葡萄酒的酒精发酵主要是在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的作用下，采用自然发酵、纯种发酵或混合发酵，将葡萄汁中的营养成分转化成酒精和其他风味物质的过程。除了酿酒酵母外，在葡萄汁自然发酵的前期和中期还存在着很多不同种属的非酿酒酵母类酵母。这些微生物中的某些种已被证明在葡萄酒酿造初期，甚至发酵中期存在较大数量，起到诱发酒精发酵的作用，并且对葡萄酒的香气、风味产生重大影响，但在酒精发酵后期，非酿酵母的种类和数量都急剧下降。因此，可以将酿酒酵母对酒精和SO2的抗性能力作为与其它酵母菌株进行区分的初步筛选依据之一。酒精发酵结束后，绝大多数葡萄酒需要继续进行苹乳发酵，以将口味酸涩的苹果酸转化为口感柔和的乳酸和二氧化碳。在这一过程中乳酸菌起到了不可替代的作用。在苹乳发酵自然启动的葡萄酒中，存在不同种类的耐受高浓度乙醇乳酸菌，如酒类酒球菌（Oenococcus oeni）、植物乳杆菌和乳酸片球菌等。其中酒类酒球菌往往是最占优势的菌群。但是，自然条件下引发的苹乳发酵却存在着极大的不确定性，有时会造成发酵迟滞甚至停止，进而造成酒质败坏，甚至产生生物胺和氨基甲酸乙酯等有害物质。因此，在酒精发酵结束的葡萄酒中，人工接种适当的乳酸菌是目前经常采用的方法。在大多数经过商业化生产的苹乳发酵剂菌株中，酒类酒球菌最为常见。据国际葡萄与葡萄酒组织(OIV)统计，2012年全世界葡萄酒消费总量约为247.2亿升至2547亿升。进入新千年后，中国葡萄酒产量一直保持两位数的增幅。2012年，全国葡萄酒的产量约为22亿升，同比增长16.9%。但是，我们不得不承认，如此之大的葡萄酒产量，却几乎全部由进口葡萄酒发酵剂酿造而成。目前世界比较著名的葡萄酒产地，如法国、西班牙、意大利等国非常重视本土优良葡萄酒酿造菌种的选育和特性研究，使得这些国家的发酵剂在世界上广受欢迎，享有很高的声誉，同时也给这些国家带来了巨大的经济和社会效益。而中国在这方面的发展则相对滞后，至今国产葡萄酒发酵剂在市场上仍十分罕见，这使得我国国产葡萄酒缺乏产地特色，与外国进口葡萄酒同质化问题严重，限制了国产葡萄酒的发展。此外，由于葡萄品种、栽培环境及工艺条件等差异，引入菌种并不能完全表现出其良好品质，这样会导致国产葡萄酒质量不稳定，给葡萄酒企业带来不同程度的经济影响。造成国产葡萄酒发酵剂研究一直滞后的重要原因是传统手工筛选方法的工作量大、研发周期长，需要耗费大量人力、物力和时间。无论是早期的自然发酵还是现代的人工接种发酵，葡萄酒酿造均是一个复杂的微生态环境演替过程，酵母菌和乳酸菌之间存在着相互影响，并对葡萄酒的风味起着不同作用。在葡萄酒酿造过程中，高浓度的糖或乙醇含量使酵母和乳酸菌只有通过发酵途径进行代谢。例如，在酿酒酵母酒精发酵生成乙醇和CO2的同时，还可将葡萄汁中一少部分的糖份（约8%）通过甘油丙酮酸途径（glyceropyruvic pathway）转化为甘油和丙酮酸；酵母细胞再将丙酮酸转化为种类繁多且含量很低、但对葡萄酒风味产生重大影响的副产物，如有机酸、酯类、醛类和高级醇等。因此，选用不同的发酵剂菌株在相同条件下用同一种葡萄酿造出来的葡萄酒是不同的，有些差别更是极为显著。根据这些微生物在代谢框架上的差异，可以对这些葡萄酒酿造用菌株进行差异化区分。葡萄酒酿造用微生物筛选的目的就是在酒精发酵过程中使葡萄汁中的糖分有效地转化为酒精并酿造出优质的葡萄酒，而在苹乳发酵过程中将苹果酸转化为乳酸。如果酿酒工艺中所用发酵菌株不适合于葡萄酒酿造或在酿造特性上存在重大缺陷，会使酿出的葡萄酒品质低下，导致顾客满意度下降，进而造成重大经济损失。在葡萄酒酿造用微生物筛选研究领域是有一系列为国际所公认的筛选标准可供参考的，主要是依据酿造优质葡萄酒所需特性进行判断，并经过数年的酿造研究最终确定是否具有成为商业菌株的潜力。一般情况下，在筛选过程中，葡萄酒酿造用微生物的特性主要分为两类：（1）影响酒精发酵进程的特性，即工艺特性（technological characteristics）；（2）决定葡萄酒最终质量和风格的特性，即品质特性（qualitative characteristics）。酿酒酵母的工艺特性影响着发酵的效率和进程。快速且完全的利用葡萄汁中糖类并产生高含量的乙醇（>8%,v/v）是葡萄酒酿酒酵母最重要的工艺特性。葡萄酒酿造过程中的各种逆境条件使得发酵菌种必须具有对这些逆境的抵抗能力，比如对高初始糖含量、高酒精含量、高SO2浓度和高Cu2+浓度具有抗性，并且具有一定抗氧化能力和对温度变化的适应能力。此外，葡萄酒用酿酒酵母还应具有泡沫产量低、产酶特性及在发酵过程中分散性好而发酵结束后沉降速度快等技术特性。酿酒酵母的品质特性决定所酿葡萄酒的化学成分并影响着酒体的感官特征。因此，酿酒酵母的质量特性是可以利用检测手段进行定量测定的。优良的葡萄酒酿酒酵母产生一系列组分平衡的风味代谢物，如甘油、琥珀酸、酯类及高级醇等挥发性香气物质，且任何一种对葡萄酒风味（如乙酸、乙酸乙酯、H2S、SO2、乙醛等）或安全性（氨基甲酸乙酯、生物胺）不利的物质的产量都不超过限值，并且赋予葡萄酒优雅的色泽及复杂的口感。对于苹乳发酵微生物，对高乙醇浓度、低温、SO2、低pH及噬菌体具有抗性，在苹乳发酵过程中能够快速启动并完成发酵，在发酵过程中不产生生物胺和氨基甲酸乙酯，同时在苹乳发酵过程中能够产生2,3-丁二醇等对葡萄酒风味起促进作用物质等都属于苹乳发酵菌株重要的工艺特性。在苹乳发酵过程中，由于乳酸菌自身存在的酯酶、葡萄糖苷酶等酶类，可以产生一些对葡萄酒风味有促进的物质，这些则属于苹乳发酵发酵剂的品质特性范畴。目前，科研工作者对葡萄酒酿造用微生物的筛选目标主要集中在以下五个方面：（1）改良发酵性能。如提高碳、氮源的利用率，提高对逆境的抗性，降低泡沫产量等。（2）提高加工效率。如选育各种胞外酶（蛋白酶、葡萄糖苷酶和果胶酶等）产量较高的菌株以利于提升葡萄酒的品质或促进葡萄酒的澄清；在特殊工艺要求下筛选具有促进沉淀、悬浮及成膜等表面特性菌株；筛选或构建<本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种葡萄酒酿造用微生物的高通量筛选方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：（1）将葡萄样品依次进行无菌取样、破碎和带皮自然发酵，取样并进行稀释，将稀释的发酵液均匀涂布在特定培养基上进行培养获得所需筛选的微生物，利用高通量筛选设备对培养基上的菌落进行筛选；（2）将步骤（1）筛选得到的菌株点种在选择性固体培养基上进行培养，利用高通量筛选设备对培养基上的菌落进行初筛；（3）利用微孔板对初筛得到的菌株进行微型发酵复筛，对复筛得到的菌株进行微型发酵，发酵结束后对得到的发酵液进行代谢物分析和多元统计分析，对复筛得到的菌株进行代谢框架分组，通过分组将具有相同/相似代谢框架的菌株进行归集；（4）将归集为不同分组的菌株进行小试发酵，利用理化检测和感官评定确定适合作为葡萄酒酿造用微生物的菌株，并对该菌株进行鉴定。

【技术特征摘要】
1.一种葡萄酒酿造用微生物的高通量筛选方法，其特征在于，该方法
包括如下步骤：
（1）将葡萄样品依次进行无菌取样、破碎和带皮自然发酵，取样并进
行稀释，将稀释的发酵液均匀涂布在特定培养基上进行培养获得所需筛选的
微生物，利用高通量筛选设备对培养基上的菌落进行筛选；
（2）将步骤（1）筛选得到的菌株点种在选择性固体培养基上进行培养，
利用高通量筛选设备对培养基上的菌落进行初筛；
（3）利用微孔板对初筛得到的菌株进行微型发酵复筛，对复筛得到的
菌株进行微型发酵，发酵结束后对得到的发酵液进行代谢物分析和多元统计
分析，对复筛得到的菌株进行代谢框架分组，通过分组将具有相同/相似代谢
框架的菌株进行归集；
（4）将归集为不同分组的菌株进行小试发酵，利用理化检测和感官评
定确定适合作为葡萄酒酿造用微生物的菌株，并对该菌株进行鉴定。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤（1）中，若所需筛选的
微生物为酵母菌，所述带皮自然发酵至发酵液中残糖含量为4-100g/L、苹果
酸含量为2-15g/L时进行取样；其中，所述酵母菌优选为酿酒酵母；
若所需筛选的微生物为乳酸菌，所述带皮自然发酵至发酵液中残糖含量
为1-4g/L、苹果酸含量为0.5-2.0g/L时进行取样；其中，所述乳酸菌优选为
酒类酒球菌。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤（1）中，所述稀释的发
酵液中菌落数为10-103cfu/mL。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤（1）中，若所需筛选的

\t微生物为酿酒酵母，所述特定培养基为mWL固体培养基，利用高通量筛选
设备筛选出具有酿酒酵母菌落形态的菌株；
若所需筛选的微生物为酒类酒球菌，所述特定培养基为mMLO固体培
养基，利用高通量筛选设备筛选出具有酒类酒球菌菌落形态的菌株。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤（2）中，若所需筛选的
微生物为酿酒酵母，将步骤（1）筛选得到的菌株点种在选自ESA固体培养
基、BIGGY固体培养基、产β-葡萄糖苷酶活性菌株筛选固体培养基和产果
胶酶活性菌株筛选固体培养基中的一种或多种的选择性固体培养基上进行
一轮或多轮培养；
若所需筛选的微生物为酒类酒球菌，将步骤（1）筛选得到的菌株点种
在选自mMLOTEC固体培养基、产生物胺检测固体培养基和柠檬酸利用检测
固体培养基中的一种或多种的选择性固体培养基上进行一轮或多轮培养。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤（3）中，所述微型发酵
复筛的方法包括将步骤（2）中初筛得到的菌株转接到含第一培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁恒宇，陈博，臧传刚，陈平，林海龙，
申请(专利权)人：中粮营养健康研究院有限公司，中粮集团有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11