一种高通量筛选光动力抗菌光敏剂的方法技术

本发明专利技术为一种高通量筛选光动力抗菌光敏剂的方法。这种方法是通过水溶性阳离子共轭聚合物(简称CP)来检测光敏剂的光动力抗菌能力，CP结构式如式(I)如下，其中，R为三甲胺基、三乙胺基或三丙胺基；m取值为1–12；X为Cl、Br、I或F；n为聚合度，n＝8–20。利用CP的荧光淬灭程度对细菌的数量进行定量检测，从而对抗菌光敏剂的功效进行筛选。本发明专利技术与传统的筛选方法相比，具有精确、快速、简便、经济、直接等特点。通过水溶性共轭聚合物分子的荧光淬灭效率可以定量的测定细菌的数量，并利用其可以对光动力抗菌光敏剂的抗菌功效进行高通量筛选。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于化学传感及检测领域，涉及一种基于共轭聚合物高通量筛选光动力抗菌光敏剂的方法。
技术介绍
由于长期使用抗生素，导致许多病原微生物产生了耐药性，严重威胁公共安全卫生，成为亟待解决的重要问题。近些年，除了新型抗生素的研发外，光动力抗菌化学疗法(PACT)在对病原菌杀伤方面得到了越来越多的关注。PACT是指利用光敏剂在光照条件下产生活性氧物种对病原菌进行杀伤，这种方法不会使病原菌产生耐药性，是一种高效优良的抗菌方法。目前已经被文献报道的抗菌型光敏剂主要包括卟啉类衍生物、共轭聚合物、BODIPY化合物和钌多吡啶配合物。抗菌型光敏剂的抗菌活性主要取决于经过光照后产生活性氧的产率。目前，对抗菌型光敏剂的筛选工作耗时长、费用高、劳动强度大，而且实验结果受操作条件的影响很大。因此开发一种简单、经济、快速的筛选光动力抗菌光敏剂的方法显得非常重要。共轭聚合物是一类具有强的光捕获能力和光信号放大效应的高分子聚合物，目前已成功应用于信号传感，疾病诊断、生物检测、生物医学成像等方面。共轭聚合物作为荧光传感器，它可以实现对被检测物快速、准确、实时的在线检测，其灵敏度高、选择性强、操作简便。水溶性共轭聚噻吩衍生物在温度、相反电荷底物及pH值等外界环境影响下，光学性质可发生明显变化。聚噻吩可以通过静电及疏水相互作用与带负电的大肠杆菌结合，从而使其聚集状态发生改变，发生荧光淬灭。因此，可以利用聚噻吩类共聚物荧光淬灭效率检测用抗菌光敏剂抗菌后的细菌数量，从而检测抗菌型光敏剂的抗菌功效。
技术实现思路
本专利技术的目的为针对当前市场上光敏剂种类繁多，筛选具有抗菌能力光敏剂或检测其其抗菌能力强弱的工作量大且繁复的缺点，提供一种利用共轭聚合物高通量筛选光动力抗菌光敏剂的方法。专利技术人通过研究发现，CP是一种可以发荧光的聚合物，细菌与其结合能够引起其发生聚集，使得它的荧光发生淬灭，细菌越多荧光淬灭越严重，因此，本专利技术通过共轭聚合物CP来检测光敏剂的光动力抗菌能力，利用CP的荧光淬灭程度对细菌的数量进行定量检测，从而对抗菌光敏剂的功效进行筛选。本专利技术的技术方案为：一种高通量筛选光动力抗菌光敏剂的方法，包括以下步骤：(a)将带负电的细菌溶于第一缓冲液中得到溶液a，其浓度为0.5–5.0OD；(b)将光敏剂溶液，加入溶液a中，使光敏剂的浓度为0.1–100.0μM，室温下，光照孵育1–20分钟，光强度为50–150mW/cm2，得到溶液b；(c)将培养基加入所获溶液b中，37℃下孵育1-5小时，得到溶液c；其中，体积比为溶液b：培养基＝1：1～3；(d)取上步得到的溶液c，向其中加入共轭聚合物和检测缓冲溶液，室温下孵育1–10min，得到溶液d；其配比为每20μL步骤(c)得到的溶液中加入100～200μL检测缓冲溶液；加入共轭聚合物溶液使得溶液d中共轭聚合物的浓度为0.1–100.0μM；(e)用紫外灯下照射溶液d，与相同条件下参比溶液中的聚合物荧光颜色相比较，可以判定光敏剂是否具有抗菌性(即，当荧光颜色为与参比溶液中未加光敏剂的空白试验时同为暗绿色，说明所含的光敏剂不具有抗菌性；而当荧光颜色为比参比溶液中未加光敏剂的空白试验中的颜色更为明亮时，说明所含的光敏剂具有抗菌性)；或者，根据激发光波长400–450nm下溶液d的荧光强度值，与相同条件下标准曲线的荧光值的比值，可以判断得到光敏剂作用后的细菌数量，进而判断光敏剂抗菌性的功效，进行筛选；所述的水溶性阳离子共轭聚合物(简称CP)结构式如式(I)所示：其中，R为三甲胺基、三乙胺基或三丙胺基；m取值为1–12；X为Cl、Br、I或F；n为聚合度，n＝8–20。所述的培养基的制备具体为称取2g胰蛋白胨、1g酵母提取物、2g NaCl加入锥形瓶中，加入200mL超纯水，高温灭菌后，冷却到室温，3～6摄氏度冷藏待用。所述的光敏剂优选为为卟啉类衍生物、BODIPY化合物和钌多吡啶配合物、共轭聚电解质。所述的光敏剂最优选为吡啶基卟啉(TMPyP)、苯基卟啉(TMP)、亚甲蓝(MB)、甲苯胺蓝(TBO)、血卟啉(HP)或二氢卟吩(PC)、阳离子聚对苯撑乙炔(CPe-1)、钌-头孢菌素(BLRu)。所述的表面带负电的细菌，具体为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、乳酸菌、硝化细菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌、白色念珠菌、根瘤菌或金黄色葡萄球菌。所述的步骤a)中的第一缓冲液为PBS缓冲液、Tris缓冲液、PB缓冲液、HEPES缓冲液。优选为PBS缓冲液。所述的步骤d)中的检测缓冲液为PBS缓冲液、Tris缓冲液、PB缓冲液、HEPES缓冲液或40％醇水。所述紫外灯为365nm的紫外灯,照射时样品与紫外灯的距离为1–5cm。所述的参比溶液中的聚合物荧光颜色的获得方法，包括以下步骤：(a)将带负电的细菌溶于第一缓冲液中得到溶液a，其浓度为0.5–5.0OD；(b)取溶液a在室温下，光照孵育2–20分钟，光强度为50–150mW/cm2，得到溶液b；(c)将培养基加入所获溶液b中，37℃下孵育1-5小时，得到溶液c；其中，体积比为溶液b：培养基＝1：1～3；(d)取上步得到的溶液c，向其中加入共轭聚合物和检测缓冲溶液，室温下孵育1–10min，得到溶液d；其中，每步骤(c)得到的溶液20μL加入100μL检测缓冲溶液，溶液d中共轭聚合物浓度为0.1–100.0μM；(e)用紫外灯下照射溶液d，通过肉眼可观测到参比溶液中的聚合物荧光颜色。(为暗绿色，)所述的标准曲线的荧光值获得方法，包括以下步骤：将浓度相同的共轭聚合物溶液与不同数量的细菌在96孔板中混合，得到一系列细菌浓度为0–5×107CFU mL-1孔板溶液，其中，溶液中共轭聚合物的浓度为0.1–100.0μM数量，然后孵育1min，用多功能酶标仪读取制备完成样品的荧光光谱，激发光为400–450nm，得到发射光谱为400–800nm的荧光强度值。本专利技术的实质性特点为：基于共轭聚合物的高通量筛选抗菌光敏剂的方法，其特征在于，基于阳离子共轭聚合物(CP)与带负电的细菌相互作用，通过细菌对CP的荧光淬灭效率定量检测经过光敏剂抗菌后的细菌数量，进而诊断光动力抗菌光敏剂的功效。本专利技术的有益效果为：基于共轭聚合物所建立的高通量筛选光动力抗菌光敏剂的方法，与传统的筛选方法相比，具有精确、快速、简便、经济、直接等特点。通过水溶性共轭聚合物分子的荧光淬灭效率可以定量的测定细菌的数量，并利用其可以对光动力抗菌光敏剂的抗菌功效进行高通量筛选。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高通量筛选光动力抗菌光敏剂的方法，其特征为包括以下步骤：(a)将带负电的细菌溶于第一缓冲液中得到溶液a，其浓度为0.5–5.0OD；(b)将光敏剂溶液，加入溶液a中，使光敏剂的浓度为0.1–100.0μM，室温下，光照孵育1–20分钟，光强度为50–150mW/cm2，得到溶液b；(c)将培养基加入所获溶液b中，37℃下孵育1‑5小时，得到溶液c；其中，体积比为溶液b：培养基＝1：1～3；(d)取上步得到的溶液c，向其中加入共轭聚合物和检测缓冲溶液，室温下孵育1–10min，得到溶液d；其配比为每20μL步骤(c)得到的溶液中加入100～200μL检测缓冲溶液；加入共轭聚合物溶液使得溶液d中共轭聚合物的浓度为0.1–100.0μM；(e)用紫外灯下照射溶液d，与相同条件下参比溶液中的聚合物荧光颜色相比较，可以判定光敏剂是否具有抗菌性；或者，根据激发光波长400–450nm下溶液d的荧光强度值，与相同条件下标准曲线的荧光值的比值，可以判断得到光敏剂作用后的细菌数量，进而判断光敏剂抗菌性的功效，进行筛选；所述的水溶性阳离子共轭聚合物(简称CP)结构式如式(I)所示：其中，R为三甲胺基、三乙胺基或三丙胺基；m取值为1–12；X为Cl、Br、I或F；n为聚合度，n＝8–20。...

【技术特征摘要】
1.一种高通量筛选光动力抗菌光敏剂的方法，其特征为包括以下步骤：
(a)将带负电的细菌溶于第一缓冲液中得到溶液a，其浓度为0.5–5.0OD；
(b)将光敏剂溶液，加入溶液a中，使光敏剂的浓度为0.1–100.0μM，室温下，光照孵育1–20
分钟，光强度为50–150mW/cm2，得到溶液b；
(c)将培养基加入所获溶液b中，37℃下孵育1-5小时，得到溶液c；其中，体积比为溶
液b：培养基＝1：1～3；
(d)取上步得到的溶液c，向其中加入共轭聚合物和检测缓冲溶液，室温下孵育1–10min，
得到溶液d；其配比为每20μL步骤(c)得到的溶液中加入100～200μL检测缓冲溶液；加入
共轭聚合物溶液使得溶液d中共轭聚合物的浓度为0.1–100.0μM；
(e)用紫外灯下照射溶液d，与相同条件下参比溶液中的聚合物荧光颜色相比较，可以判定
光敏剂是否具有抗菌性；或者，根据激发光波长400–450nm下溶液d的荧光强度值，与相同
条件下标准曲线的荧光值的比值，可以判断得到光敏剂作用后的细菌数量，进而判断光敏剂
抗菌性的功效，进行筛选；
所述的水溶性阳离子共轭聚合物(简称CP)结构式如式(I)所示：
其中，R为三甲胺基、三乙胺基或三丙胺基；m取值为1–12；X为Cl、Br、I或F；n为
聚合度，n＝8–20。
2.如权利要求1所述的高通量筛选光动力抗菌光敏剂的方法，其特征为所述的培养基的
制备具体为称取2g胰蛋白胨、1g酵母提取物、2g NaCl加入锥形瓶中，加入200mL超
纯水，高温灭菌后，冷却到室温，3～6摄氏度冷藏待用。
3.如权利要求1所述的高通量筛选光动力抗菌光敏剂的方法，其特征为所述的光敏剂优
选为为卟啉类衍生物、BODIPY化合物、钌多吡啶配合物或共轭聚电解质。
4.如权利要求1所述的高通量筛选光动力抗菌光敏剂的方法，其特征为所述的光敏剂最
优选为吡啶基卟啉(TMPyP)、苯基卟啉(TMP)、亚甲蓝(MB)、甲苯胺蓝(TBO)、
血卟啉(HP)、二氢卟吩(PC)、阳离子聚对苯撑乙炔(CPe-1)或钌-头孢菌素(BLRu)。
5.如权利要求1所述的高通量筛...

【专利技术属性】
技术研发人员：邢成芬，牛瑞民，李瑞华，齐俊杰，展永，袁宏博，安海龙，
申请(专利权)人：河北工业大学，
类型：发明
国别省市：天津;12