基于电化学交流阻抗检测miRNA-21的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于电化学交流阻抗检测miRNA‑21的方法，包括：步骤一、金电极打磨、抛光、干燥；步骤二、将金电极表面浸泡于miRNA‑21适配体溶液，再依次进行电子束照射，葡萄糖水溶液浸泡，冲洗吹干；置于磁场中浸泡，冲洗吹干；滴加巯基乙醇溶液反应，冲洗吹干，得活化金电极；步骤三、制备多个活化金电极，滴加不同浓度的miRNA‑21溶液，反应后冲洗吹干，得到多个检测金电极；步骤四、检测每个浓度的miRNA‑21溶液对应的阻抗值；步骤五、计算得到阻抗值的差值与浓度的线性关系；步骤六、检测待测样液的阻抗值，采用线性关系计算得到待测样液中miRNA‑21的浓度。本发明专利技术具有检测灵敏度高的有益效果。

【技术实现步骤摘要】
基于电化学交流阻抗检测miRNA-21的方法
本专利技术涉及电化学检测领域。更具体地说，本专利技术涉及一种基于电化学交流阻抗检测miRNA-21的方法。
技术介绍
微小RNA(miRNA)是一类含有约22个核苷酸的小型非编码RNA分子，其功能是基因表达的转录和转录后调控。根据最近的一些报道，某些种类的miRNA与人类癌症密切相关，miRNA-21就是其中之一。在这些不同的miRNA中，microRNA-21被认为是一种潜在的生物标志物，因为它在许多癌组织中过表达，如肺腺癌，胶质母细胞瘤，乳腺癌，宫颈癌。此外，通过递送抑制剂调节特定的microRNA表达，它们也可以成为许多疾病的新型治疗靶点。因此，迫切需要灵敏的microRNA定量方法，具有高灵敏度和高选择性。然而，miRNA的短长度，高序列相似性和低丰度(低至每个细胞的几个分子)使得难以开发用于检测miRNA的快速，简单，灵敏和选择性电化学方法。为了克服这些缺点，已经开发了用于miRNA检测的不同生物传感策略，例如荧光，电化学发光，表面等离子共振，比色，电化学和在这些方法中，电化学生物传感器因其高灵敏度和高精度，快速响应，低成本，用户友好性，仪器简单，易于小型化等突出方面而被成为一类特别有前途的有效分析技术。针对以上问题，我们研究了一种基于miRNA-21适配体修饰电极利用交流阻抗法检测溶液中miRNA-21浓度的方法，该方法操作简单、检测快速且灵敏度高，能进行混合样品溶液中miRNA-21的高灵敏识别。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。本专利技术还有一个目的是提供一种基于电化学交流阻抗检测miRNA-21的方法，可以准确检测具有混合样品溶液中miRNA-21的浓度。为了实现根据本专利技术的这些目的和其它优点，提供了一种基于电化学交流阻抗检测miRNA-21的方法，包括：步骤一、将金电极进行打磨、抛光、洗涤干燥；步骤二、金电极活化处理：a、将步骤一中的金电极表面浸泡于浓度为2μM的miRNA-21适配体溶液中1min，然后采用强度为15kGy的电子束照射3min，再浸泡于温度度为4℃，浓度为10μM的葡萄糖水溶液中4h，再用PH为6.8的PBS溶液冲洗30s，用氮气吹干；b、用PH为6.8的PBS溶液浸泡步骤a处理后的金电极表面，并在浸泡的同时置于磁场强度为1T的磁场中，5min后取出，用浓度为5μM的硼酸的乙醇溶液冲洗15min，然后再用PH为6.8的PBS溶液冲洗30s，用氮气吹干；c、用浓度为1mM的巯基乙醇溶液滴加到步骤b处理的金电极表面，直至金电极表面布满巯基乙醇溶液，置于4℃环境中反应1h，然后用PH为6.8的PBS溶液冲洗30s，用氮气吹干，得到活化金电极；步骤三、重复步骤一和步骤二制备多个活化金电极，分别向多个活化金电极表面滴加不同浓度的miRNA-21溶液，置于37℃环境中60min，再用PH为6.8的PBS溶液冲洗30s，用氮气吹干，得到多个检测金电极；步骤四、以银氯化银电极和铂电极分别为参比电极和对电极，以步骤三中的检测金电极为工作电极，搭建多个三电极体系，采用交流阻抗法扫描得到多个交流阻抗曲线图，根据交流阻抗曲线图拟合得到每个浓度的miRNA-21溶液对应的阻抗值；步骤五、以浓度不为0的miRNA-21溶液的阻抗值减去浓度为0的miRNA-21溶液的阻抗值的差值为纵坐标，以miRNA-21溶液的浓度为横坐标，计算得到miRNA-21溶液的阻抗值的差值与浓度的线性关系；步骤六、按照步骤一和步骤二制备活化金电极，向该活化金电极表面滴加10μL含有未知浓度的miRNA-21的待测样液，置于37℃环境中60min，再用PH为6.8的PBS溶液冲洗30s，用氮气吹干，得到检测金电极；步骤七、以银氯化银电极和铂电极分别为参比电极和对电极，以步骤六中的检测金电极为工作电极，搭建三电极体系，采用交流阻抗法扫描得到一个交流阻抗曲线图，根据交流阻抗曲线图拟合得到待测样液对应的阻抗值，以该阻抗值减去浓度为0的miRNA-21溶液的阻抗值，得到差值，将该差值代入步骤五中的线性关系，计算得到待测样液中miRNA-21的浓度。优选的是，步骤一具体为：将金电极表面置于NaHCO3浓度为5μM、KCl浓度为10μM的超纯水溶液中，于温度为65℃水浴条件下浸泡40min，用超纯水冲洗后，再置于乙酸浓度为5μM、硅酸浓度为2μM的超纯水溶液中，于温度为80℃水浴条件下浸泡60min，用超纯水冲洗后，在抛光布上用0.05μm的抛光粉打磨，再用超纯水冲洗干净。优选的是，步骤三中的miRNA-21溶液的浓度分别为0mol/L、2×10-12mol/L、5×10-12mol/L、1×10-11mol/L、2×10-11mol/L，滴加到活化金电极表面的体积为10μL。优选的是，miRNA-21的核苷酸序列为：5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3'；miRNA-21适配体的核苷酸序列为5'-TCAACATCAGTCTGATAAGCTATTT-(CH2)6-SH-3'。优选的是，步骤a中的葡萄糖水溶液的配置方法为：将超纯水置于-10℃下冷冻30min，加入乙酸，使乙酸浓度为1μM，置于4℃环境中静置10min，再置于-10℃下冷冻10min，加入葡萄糖，置于4℃温度条件下，超声频率为80KHz，超声处理10min。优选的是，步骤四和步骤七中扫描参数设置为：振幅为0.005V，频率为0.1～1000Hz的条件下，在反应介质液为含有[Fe(CN)6]3-和Fe(CN)64-的溶液中进行检测，其中，[Fe(CN)6]3-和Fe(CN)64-的总浓度为5mmol。本专利技术至少包括以下有益效果：可以准确检测出溶液中仅含有10-12mol/L的miRNA-21的浓度，并且抗干扰性强，可以准确检测出含有干扰液的混合样品中的miRNA-21的浓度。本专利技术的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本专利技术的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。附图说明图1是本专利技术的实施例1中不同浓度的miRNA-21溶液的交流阻抗曲线图；图2为本专利技术的实施例1中miRNA-21的浓度与阻抗值差值的线性关系图。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。<实施例1>基于电化学交流阻抗检测miRNA-21的方法，包括：步骤一、将金电极进行打磨、抛光、洗涤干燥；步骤二、金电极活化处理：a、将步骤一中的金电极表面浸泡于浓度为2μM的miRNA-21适配体溶液中1min，然后采用强度为15kGy的电子束照射3min，再浸泡于温度度为4℃，浓度为10μM的葡萄糖水溶液中4h，再用PH为6.8的PBS溶液冲洗30s，用氮气吹干；b、用PH为6.8的PBS溶液浸泡步骤a处理后的金电极表面，并在浸泡的同时置于磁场强度为1T的磁场中，5min后取出，用浓度为5μM的硼酸的乙醇溶液冲洗15min，然后再用PH为6.8的PBS溶液冲洗30s，用氮气吹干；c、用浓度为1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于电化学交流阻抗检测miRNA‑21的方法，其特征在于，包括：步骤一、将金电极进行打磨、抛光、洗涤干燥；步骤二、金电极活化处理：a、将步骤一中的金电极表面浸泡于浓度为2μM的miRNA‑21适配体溶液中1min，然后采用强度为15kGy的电子束照射3min，再浸泡于温度度为4℃，浓度为10μM的葡萄糖水溶液中4h，再用PH为6.8的PBS溶液冲洗30s，用氮气吹干；b、用PH为6.8的PBS溶液浸泡步骤a处理后的金电极表面，并在浸泡的同时置于磁场强度为1T的磁场中，5min后取出，用浓度为5μM的硼酸的乙醇溶液冲洗15min，然后再用PH为6.8的PBS溶液冲洗30s，用氮气吹干；c、用浓度为1mM的巯基乙醇溶液滴加到步骤b处理的金电极表面，直至金电极表面布满巯基乙醇溶液，置于4℃环境中反应1h，然后用PH为6.8的PBS溶液冲洗30s，用氮气吹干，得到活化金电极；步骤三、重复步骤一和步骤二制备多个活化金电极，分别向多个活化金电极表面滴加不同浓度的miRNA‑21溶液，置于37℃环境中60min，再用PH为6.8的PBS溶液冲洗30s，用氮气吹干，得到多个检测金电极；步骤四、以银氯化银电极和铂电极分别为参比电极和对电极，以步骤三中的检测金电极为工作电极，搭建多个三电极体系，采用交流阻抗法扫描得到多个交流阻抗曲线图，根据交流阻抗曲线图拟合得到每个浓度的miRNA‑21溶液对应的阻抗值；步骤五、以浓度不为0的miRNA‑21溶液的阻抗值减去浓度为0的miRNA‑21溶液的阻抗值的差值为纵坐标，以miRNA‑21溶液的浓度为横坐标，计算得到miRNA‑21溶液的阻抗值的差值与浓度的线性关系；步骤六、按照步骤一和步骤二制备活化金电极，向该活化金电极表面滴加10μL含有未知浓度的miRNA‑21的待测样液，置于37℃环境中60min，再用PH为6.8的PBS溶液冲洗30s，用氮气吹干，得到检测金电极；步骤七、以银氯化银电极和铂电极分别为参比电极和对电极，以步骤六中的检测金电极为工作电极，搭建三电极体系，采用交流阻抗法扫描得到一个交流阻抗曲线图，根据交流阻抗曲线图拟合得到待测样液对应的阻抗值，以该阻抗值减去浓度为0的miRNA‑21溶液的阻抗值，得到差值，将该差值代入步骤五中的线性关系，计算得到待测样液中miRNA‑21的浓度。...

【技术特征摘要】
1.基于电化学交流阻抗检测miRNA-21的方法，其特征在于，包括：步骤一、将金电极进行打磨、抛光、洗涤干燥；步骤二、金电极活化处理：a、将步骤一中的金电极表面浸泡于浓度为2μM的miRNA-21适配体溶液中1min，然后采用强度为15kGy的电子束照射3min，再浸泡于温度度为4℃，浓度为10μM的葡萄糖水溶液中4h，再用PH为6.8的PBS溶液冲洗30s，用氮气吹干；b、用PH为6.8的PBS溶液浸泡步骤a处理后的金电极表面，并在浸泡的同时置于磁场强度为1T的磁场中，5min后取出，用浓度为5μM的硼酸的乙醇溶液冲洗15min，然后再用PH为6.8的PBS溶液冲洗30s，用氮气吹干；c、用浓度为1mM的巯基乙醇溶液滴加到步骤b处理的金电极表面，直至金电极表面布满巯基乙醇溶液，置于4℃环境中反应1h，然后用PH为6.8的PBS溶液冲洗30s，用氮气吹干，得到活化金电极；步骤三、重复步骤一和步骤二制备多个活化金电极，分别向多个活化金电极表面滴加不同浓度的miRNA-21溶液，置于37℃环境中60min，再用PH为6.8的PBS溶液冲洗30s，用氮气吹干，得到多个检测金电极；步骤四、以银氯化银电极和铂电极分别为参比电极和对电极，以步骤三中的检测金电极为工作电极，搭建多个三电极体系，采用交流阻抗法扫描得到多个交流阻抗曲线图，根据交流阻抗曲线图拟合得到每个浓度的miRNA-21溶液对应的阻抗值；步骤五、以浓度不为0的miRNA-21溶液的阻抗值减去浓度为0的miRNA-21溶液的阻抗值的差值为纵坐标，以miRNA-21溶液的浓度为横坐标，计算得到miRNA-21溶液的阻抗值的差值与浓度的线性关系；步骤六、按照步骤一和步骤二制备活化金电极，向该活化金电极表面滴加10μL含有未知浓度的miRNA-21的待测样液，置于37℃环境中60min，再用PH为6.8的PBS溶液冲洗30s，用氮气吹干，得到检测金电极；步骤七、以银氯化银电极和铂电极分别为参比电极和对电极，以步骤六中的检测金电极为工作电极，搭建三电极体系，采用交流阻抗法扫描得到一个交流阻抗曲线图，根据交流...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖琦，黄珊，李家文，金晓宇，
申请(专利权)人：广西师范学院，
类型：发明
国别省市：广西,45