一种产细胞色素P450酶及其电子传递系统工程菌的构建及其应用技术方案

本发明专利技术公开了一种产细胞色素P450及其电子传递系统的基因工程菌株的构建及其应用，属于生物技术领域。该菌株为利用灰色链霉菌(ATCC13273)内源性铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶作为P450酶CYP105D1电子传递系统的工程菌株，利用该菌株能实现对左旋四氢巴马汀特异性的氧位去甲基化，为利用基因工程菌株生物转化生产左旋紫堇达明提供了可行性。同时，本发明专利技术公开的几种可支撑CYP105D1生物催化的铁氧还蛋白还原酶，均可提高CYP105D1对多种天然产物的生物转化能力，除左旋四氢巴马汀，还能对华法林，7‑乙氧基香豆素等天然产物实现高效转化，为基于P450的高效生物转化提供了又一实例。

Construction and application of an engineering bacterium producing cytochrome P450 enzyme and its electron delivery system

The invention discloses a construction and application of a genetic engineering strain for producing cytochrome P450 and an electron delivery system thereof, belonging to the technical field of biotechnology. For the use of the strain of Streptomyces griseus (ATCC13273) endogenous ferredoxin and ferredoxin reductase enzyme as P450 CYP105D1 electron transport system engineering strain, the strain can achieve on the left four hydrogen bar Martin specific oxygen de methylation, provide the feasibility of using gene engineering Cheng Junzhu bioconversion of Corydalis damien. At the same time, several kinds of ferrite disclosed by the invention can support CYP105D1 bio catalytic protein reductase, can improve the CYP105D1 of biotransformation of natural products, in addition to the left four hydrogen Pakistan Martin, but also on warfarin, 7 ethoxycoumarin natural products to achieve efficient conversion, and an example is provided for P450 efficient based on the biological transformation.

【技术实现步骤摘要】
一种产细胞色素P450酶及其电子传递系统工程菌的构建及其应用
：本专利技术属于生物技术生物转化领域，具体涉及一种共表达细胞色素P450及其电子传递系统工程菌株的构建并应用此工程菌株生物转化生产左旋紫堇达明等天然产物的方法和应用。
技术介绍
：细胞色素P450酶系(简称为CYP)，是作为一种能与CO结合的蛋白质而被发现的。1958年Klingenberg在大鼠肝微粒体中发现了这种能与CO结合的色素蛋白。也正是由于其还原态与CO结合时在450nm波长处有最大吸收值，因而命名为细胞色素P450。P450作为最为庞大的氧化还原酶超家族，广泛分布于绝大部分生物中，目前其广泛用于药物代谢研究以及工业生物转化领域。因细胞色素P450具备在温和条件下，还原大气中的氧分子，将底物进行区域选择性和手性专一性氧化的优势，如今P450在生物转化中扮演了重要的角色。但是由于细胞色素P450催化过程中需要高效的电子传递系统，需要辅酶的供应以及自身的不稳定性导致其至今并没有很多的成功案例应用于工业生物转化中。而电子传递系统在细胞色素P450催化过程中扮演了最为重要的角色之一，因此筛选合适高效的细胞色素P450电子本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于细胞色素P450进行生物转化天然产物的基因工程菌，其特征在于，将细胞色素P450基因，高效电子传递系统(铁氧还蛋白基因和铁氧还蛋白还原酶)基因通过质粒转化到大肠杆菌中共表达构建而成的重组工程菌。

【技术特征摘要】
1.一种基于细胞色素P450进行生物转化天然产物的基因工程菌，其特征在于，将细胞色素P450基因，高效电子传递系统(铁氧还蛋白基因和铁氧还蛋白还原酶)基因通过质粒转化到大肠杆菌中共表达构建而成的重组工程菌。2.根据权利要求1所述的工程菌株，其特征在于细胞色素P450基因为CYP105D1，来自于灰色链霉菌(StreptomycesgriseusATCC13273)，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。3.根据权利要求1所述铁氧还蛋白基因，其特征在于可以是来自于恶臭假单胞菌中的铁氧还蛋白基因(camB)，其核苷酸序列如SEQIDNO：2。或者为来自于灰色链霉菌ATCC13273中与CYP105D1串联的铁氧还蛋白基因(fdx1)，其核苷酸序列如SEQIDNO：4所示。4.根据权利要求1所述铁氧还蛋白还原酶基因，其特征在于，可以为来自于恶臭假单胞菌中的铁氧还蛋白还原酶基因(camA)，其核苷酸序列为SEQIDNO：3所示，经过密码子优化，更适用于大肠杆菌宿主表达，也可以是来自于灰色链霉菌ATCC13273中的铁氧还蛋白还原酶基因，fdr1或fdr5或fdr6。5.根据权利要求4所述的来自于灰色链霉菌ATCC13273中的铁氧还蛋白还原酶基因，fdr1、fdr5和fdr6。其中fdr1的核苷酸序列为SEQIDNO：5，fdr5的核苷酸序列如SEQIDNO：6所示，fdr6的核苷酸序列如SEQIDNO：7所示。6.根据权利1-5所述共表达细胞色素P450及其高效电子传递系统的工程菌的构建及诱导表达方法，包括如下步骤：1)从灰色链霉菌ATCC13273基因组中扩增获得CYP105D1基因；2)根据NCBI中camB核苷酸序列(GenBank登陆号...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘吉华，沈辰，徐涛，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32