本发明专利技术提供一种定性检测细胞色素氧化酶CYP2C19基因分型的测序引物对及其试剂盒，属于体外核酸检测领域，所述试剂盒包括尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶、PCR反应液、PCR扩增引物、焦磷酸测序引物、以及阳性对照品；本发明专利技术提供的试剂盒灵敏度高，特异性好，PCR产物简单处理即可上焦磷酸测序仪测序，操作简便，反应时间短，比金标准——毛细管电泳测序灵敏度高，更适合用于突变分析。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及体外核酸检测领域，尤其涉及一种在临床样本中检测常用药物代谢的细胞色素氧化酶CYP2C19基因的两个位点的基因分型的测序引物对及其试剂盒，即CYP2C19*2 (681G/A)与 CYP2C19*3 (636G/A)两个位点的基因分型。
技术介绍
细胞色素P450(CytochromeP450，CYP450)是由一组结构和功能相关的超家族基因(Superfamily gene)编码的同工酶，在人类身体中，其主要存在于肝细胞微粒中。在CYP450超家族中，CYP2是最大的家族，有15个亚家族，它们代谢约20%目前临床使用的药物。其中CYP2C19 (S-美芬妥英羟化酶)是CYP450的主要成分之一，CYP2C19基因cDNA全长1940，含有9个外显子，编码区为1473bp。其编码的蛋白S-美芬妥英羟化酶代谢一系列临床药·物，如氯吡格雷、美芬妥英、奥美拉唑、普萘洛尔、地西泮、去甲地西泮、舍曲林等。研究表明很多药物代谢表型的差异源于CYP2C19基因突变，中国人常见的两种单核苷酸突变为CYP2C19*2型和CYP2C19*3型，分别为CYP2C19基因的第5外显子G681A和第4外显子G636A的突变。其中CYP2C19*2型G681A点突变产生了一个异常的拼接位点，使外显子5 '端的前40bp核苷酸发生缺失，改变了随后mRNA的阅读框，从而使蛋白的合成过早终止，使其合成的S-美芬妥英羟化酶缺乏血红素结合位点，使其失去活性。CYP2C19*3型G636A点突变使编码色氨酸密码子变为终止子，也导致蛋白合成提前终止，使合成的酶缺乏血红素及底物结合区而失去活性。这些点突变引起了 S-美芬妥英羟化酶的活性和下降，代谢底物的能力减弱，使血药浓度增高，从而引起与血药浓度相关的药品不良反应。根据CYP2C19基因型改变而引起酶代谢活性的改变，可将人群根据对药物代谢能力分为三大类药物强代谢型(EM，extensive metabolisers)CYP2C19野生型，CYP2C19杂合型代表的是中间代谢型(頂)，弱代谢型(PM)为突变型纯合子。CYP2C19*2在中国人中发生率是30%，CYP2C19*3是5%，而这两种突变几乎涵盖了中国人所有的弱代谢型(PM)。CYP2C19基因型与肿瘤发病危险性CYP2C19基因的遗传多态性与多种肿瘤癌症的发生有关。研究结果表明，CYP2C19可能参与食管癌、胃癌、肺癌、急性白血病鳞状细胞肺癌、肝癌等前致癌物的活化，即CYP2C19基因的突变将增加患食管癌、胃癌、肺癌、急性白血病鳞状细胞肺癌、肝癌的危险性。因此，对人群中CYP2C19基因进行分型检测，能为临床上对某些肿瘤的易感性预测以及早期癌变预警提供重要的理论依据，有助于肿瘤癌症的前期预防。CYP2C19基因主要影响的几种药物代谢有氯吡格雷氯吡格雷为噻吩并吡啶衍生物，是一类新型的抗血小板药物，氯吡格雷本身无治疗效应，它由细胞色素P450氧化生成活性代谢产物(一种硫醇衍生物)而发挥作用。CYP2C19的变异是目前发现的氯吡格雷疗效个体差异的主要原因。CYP2C19基因的突变降低了氯吡格雷抗血小板聚集的疗效，并呈现出基因剂量效应。美芬妥英美芬妥英是临床常用广谱抗癫痫药，其血药浓度、疗效和不良反应存在显著个体差异，主要与药物代谢及反应的遗传多态性有密切关系。其中CYP2C19基因多态性可引起不同个体服用美芬妥英后出现特异性的药理及毒理作用，造成药物治疗效果的差巳升。 奥美拉唑奥美拉唑是目前应用最为广泛的质子泵抑制剂(PPI)之一,能抑制胃酸分泌，但长期大剂量使用将增加患者骨折的危险。在CYP2C19强代谢型人群中，奥美拉唑80%都是由CYP2C19代谢。故此，CYP2C19基因突变型人群使用奥美拉唑的疗效显著低于CYP2C19基因野生型人群。CYP2C19基因参与的药物代谢还包括普萘洛尔、地西泮、去甲地西泮、舍曲林等，患者对这些药物的敏感性、耐药性以及不良反应状况都与患者本身CYP2C19基因多态性相关。因此根据检测CYP2C19基因型的多态性来选择用药或者选择最小有效剂量治疗方案有重要的临床意义。目前医院用于CYP2C19基因分型检测的“金标准”是PCR-直接测序法，但直接测序法的敏感性不高，只能检测出突变细胞比率在10-20%以上的肿瘤组织，对于含〈10%突变细胞的肿瘤组织以及外周血，常规PCR+直接测序法几乎无能为力。相比于直接测序法，焦磷酸测序的灵敏性更高、成本更低。焦磷酸测序(Pyrosequencing)是一种基于聚合原理的DNA测序(确定DNA中核苷酸的顺序)方法，是新一代DNA序列分析技术。它是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。通过分析出峰情况，达到测定DNA序列的目的目前市场上还没有利用焦磷酸技术进行CYP2C19的基因多态性检测的产品。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种特异性高、准确性好、能够定性检测细胞色素氧化酶CYP2C19基因分型的测序引物对及其试剂盒。为了达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案一种检测CYP2C19基因分型的焦磷酸测序引物对，所述引物对为如下引物CYP2C19*2 正向扩增引物5' -CCAGAGCTTGGCATATTGTATCTA-3' (SEQ ID NO. I)；CYP2C19*2 反向扩增引物5' -CGCAAGCAGTCACATAACTAAGC-3' (SEQ ID NO. 2)CYP2C19*2 测序引物5' -AAGTAATTTGTTATGGGTTC-3' (SEQ IDN0. 3)CYP2C19*3 正向扩增引物5' -GCAATGTGATCTGCTCCATTATTT-3' (SEQ ID NO. 4)CYP2C19*3 反向扩增引物5' -GCAAAAAACTTGGCCTTACCTG-3' (SEQID NO. 5)CYP2C19*3 测序引物5' -TTGTAAGCACCCCCT-3' (SEQ ID NO. 6)其中，CYP2C19*2正向扩增引物(SEQ ID NO. I)和 CYP2C19*3 (SEQ IDNO. 5)反向扩增引物的5'端分别进行生物素标记。一种定性检测细胞色素氧化酶CYP2C19基因分型的测序试剂盒，所述试剂盒包括含有SEQ ID NO. 2所示反向扩增引物的PCR反应液1，含有SEQ ID NO. 4所示正向扩增引物的PCR反应液2，SEQ ID NO. I所示的正向扩增引物，SEQ IDNO. 5所示的反向扩增引物，SEQID NO. 3和SEQ ID NO. 6所示的测序引物；其中，SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 5所示引物的5’端进行生物素标记。进一步地，所述试剂盒中还包括质控品TAYGGTTTGCA (SEQ ID NO. 7) (controloligo)和作为空白对照品的超纯水；质控序列是由QI本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种定性检测细胞色素氧化酶CYP2C19基因分型的测序引物对，其特征在于，所述引物对为SEQ？ID？NO.1和SEQ？ID？NO.4所示的正向扩增引物，SEQ？ID？NO.2和SEQ？IDNO.5所示的反向扩增引物，SEQ？ID？NO.3和SEQ？ID？NO.6所示的测序引物；其中，SEQID？NO.1和SEQ？ID？NO.5所示引物的5’端进行生物素标记。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周姗，
申请(专利权)人：长沙三济生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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