本发明专利技术公开一种原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针和标记物。还公开使用本试剂盒原位杂交检测与乳腺癌变前期病理演变有密切相关的磷酸甘油酸脱氢酶（PHGDH）基因的mRNA方法，包括以下步骤：（1）在杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物中待测RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和（2）检测所述杂交复合体。本发明专利技术的试剂盒和检测方法可在mRNA水平上检测PHGDH基因的表达量，比影像医学和现有的临床生化检测指标更早期，能实现真正的癌变前期mRNA水平筛查，同时，本发明专利技术的检测方法简单方便，成本低,便于县区级医院推广应用。?
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测领域，更具体地说，是涉及与乳腺癌变前期的mRNA表达改变(病理演变过程)的相关检测技术。
技术介绍
根据国内外权威机构提供的资料，我国每年癌症的新增人数260万，死亡人数近210万，患者700多万，全球每年新增癌症患者800万，死亡人数接近800万，患者约有8400多万人，到2020年以上人数将翻一番，这是一组可怕的数字。癌症诊治成本越来越高，按癌症患者的年治疗费用20万(贫穷地区可能偏高，发达地区可能远远高出20万)，700多万患·者，每年的花费是I. 4万亿，扣除成本35%约4千亿，每年约有I万亿人民币白白消耗了。而且，癌症患者大部分会在治疗后不久死亡。因此，现有的临床癌症诊治模式一定要改变，本专利技术的创新点是提前做到预防性筛查，然后及时介入预防性调控和预防性治疗，做到基因水平癌症的治未病。2005年美国卫生研究院、癌症研究院、疾控中心等八家单位做了一个年度报告，对1972年发起的抗癌大战进行回顾，报告认为人类在抗癌大战中是失败，结论是癌症死亡率没有降低，其列举出造成抗癌大战失败的几个因素是1.肿瘤细胞异质性(多态性);2.肿瘤细胞耐药性；3.抗癌药物设计思路不完善(动物模型设计不科学)等。同时，该报告中亦提出应重新审视现有诊治癌症的措施。本专利技术人在长期研究中发现，导致癌症死亡率不降的重要原因是不能做到真正的早期诊断。依照现有的临床医学影像(B超、CT、核磁共振成像等)及和其它生化(癌抗原、癌胚抗原、糖类激素、细胞膜因子、细胞核因子、细胞流式技术)指标来诊断癌症，都是肿瘤形成后诊断，前者要有组织学变化或已有占位性病变，后者大部分是肿瘤形成后所分泌、释放、或肿瘤的标记物。传统临床观念认为占位性癌块在2公分下是属于早期癌症的诊断，这一概念值得认真讨论，2公分以下癌块属早期这一界定科学性是不够严谨的，从细胞学角度来分析，I公分的肿块约有一亿个肿瘤细胞，2公分的肿块其三维空间的细胞叠加数远不止2亿个肿瘤细胞，从癌变前期到单克隆癌细胞产生及形成2公分的癌块，其病理演变过程相当长，可能是5年或10年、甚至是10年以上(特殊病例除外)，很难证实的是在这个病理演变过程中，肿块是癌症唯一的发生地和单独的病灶，可能癌细胞早已迁移到其它组织或器官生长。临床研究早已证实，一旦形成肿块的同时，其它癌细胞通过不同途径迁移到其它部位克隆生长，一旦切除原发灶后，其它器官复发灶或多发癌块灶先后形成。因此，在临床上以2公分以下的癌肿块大小来界定早期与否，不够严谨(有些病例，在发现原发病灶时，同时发现转移病灶，不在我们表述的内容中)，其实这时已经是晚期诊断和晚期治疗，这是导致癌症死亡率不降的真正原因。随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，癌症基因组学等研究的深入展开，为了寻求更早期的诊断癌症、治疗癌症、以及预防癌症，已取得长足进步。至今，我们已有可能在基因的一级转录功能产物(mRNA水平)上做更精确的早期筛查和诊断，在癌变前期或癌细胞形成(单克隆)前，就可以做到早期预测和筛查。本专利技术采用核酸原位杂交技术，选择多组临床标本(癌症病人、高危人群、家属史人群、正常对照)，对PHGDH基因与乳腺癌的早期预警进行检测分析。乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，这种疾病通常发生在乳房腺上皮组织，发病率占各种恶性肿瘤的7-10%，是一种严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见恶性肿瘤之一，发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌而列居第三位。美国的研究人员巧妙地将癌症基因组学技术与R NA干扰技术相结合，在乳腺癌小鼠模型中高通量筛查了 2725个代谢酶和运输子基因，从中发现了 198个与侵袭性乳腺癌相关的基因，其中包括一个被称为磷酸甘油酸脱氢酶(PHGDH)的基因。研究人员发现PHGDH存在于“染色体lp”的一个区域，该区域在约70%的雌激素受体(ER)阴性乳腺癌中经常被放大，导致PHGDH过度表达。PHGDH的水平升高引起通过丝氨酸合成通道的代谢流量增加，这反过来又会对谷氨酸盐通过三羧酸循环向-酮戊二酸盐的流入做出显著贡献。当研究人员在这些乳腺癌细胞中抑制PHGDH基因表达，发现细胞增殖受到抑制，丝氨酸合成下降。进一步的分析证实PHGDH抑制并不会影响细胞内丝氨酸水平，而主要是导致三羧酸循环向-酮戊二酸盐的流入的降低。这些研究结果表明，以PHGDH为具体目标，作为乳腺癌变前期筛查的靶基因有一定的临床意义。将PHGDH的mRNA作为早期筛查乳腺癌变前期有非常重要的临床诊断意义。PHGDH的mRNA在乳腺癌变前期及癌变过程中表达过度。它作于乳腺癌变前期筛查、及乳腺腺癌治疗后的复发、转移预警也有非常重要的临床意义。专利技术人在长期的研究中，得出了一种新理念，癌症和其它临床的重大疾病的临床诊治模式一定要改变，不能只停留现在治已病(发病后诊治)，要做到预防性诊治，做到治已病,只有这样才能降低重大疾病的发病率和死亡率,降低社会成本和医疗成本。因此,专利技术人在开发和生产重大疾病的mRNA水平筛查试剂盒及治疗药物中，在理论和技术上都做了大胆创新。特别是筛选临床标本(正常人群、癌症高危人群、癌症好发人群、肿瘤患者)，突破了正常组织与肿瘤组织比较的一贯性研发思路，来寻找和开发癌前变的mRNA水平，与癌症早期基因病理生理学演变密切相关，而且临床意义非常重要靶标，将临床上肿瘤形成后诊治模式变成肿瘤的预防性诊治，争取了肿瘤诊治的时间和空间，达到预防癌症。目前对PHGDH基因的研究都采用高通量基因芯片技术，而这些方法多用于科研方面，不适应临床应用，特别是个性化的应用在我国现阶段条件尚不成熟。根据现有的文献资料PHGDH基因mRNA水平的检测技术及试剂盒未见报道。本专利技术人在针对创新性专利技术的要求，设计了不同数据例组(乳腺癌患者、高危人群和家属发病史人员、正常对照人)例组，用原位杂交技术进行检测，结果表明以上乳腺癌症病人PHGDH基因都过度表达，高危人群有不同程度表达15-25%，家属发病史人员有几例呈低表达，正常人都是零表达。表明PHGDH基因乳腺癌变前期筛查的重要标志物。原位杂交技术(in situ hybridization)是将分子生物学与细胞化学技术结合起来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。其原理是使含有特异序列、经过标记的核酸单链(即探针)，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。原位杂交的探针是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分子(虽不明确该分子全部序列，但已知其针对何靶分子)，探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探针、cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸探针。为了便于示踪，探针必须用一定的手段加以标记，以利于 以后的检测。常用的标记物包括放射性核素和非放射性标记物两大类。常用的同位素标记物有3H、35S、125I和32P。同位素标记物虽然有灵敏性高、背底较为清晰等优点，但是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害，近来有被非同位素取代的趋势。非同位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。检测这些标记物的方法都是极其灵敏的。根据所用探针及所要检测核酸的不同又可分为DNA-DNA, R本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针和标记物，其特征在于，所述的杂交探针为序列表SEQ？ID？NO.1所示的序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：裘霖，张玉丽，裘建英，张云福，
申请(专利权)人：芮屈生物技术上海有限公司，
类型：发明
国别省市：
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