本发明专利技术涉及细胞色素P450酶，特别涉及一种改进细胞色素P450酶家族体外表达的方法。一种改进细胞色素P450酶家族体外表达的方法，其特征在于在步骤D所述的辅助因子为如下任意一种：①0.5-6μg/mlHemin；②0.05-0.6mM5-ALA；③0.01-0.4mMFe3+；④0.05-0.6mM-ALA和0.01-0.4mMFe3+混合物，首次对CYP蛋白、POR蛋白及其共表达的条件进行了系统优化，结果发现同时给予0.02mMFe3+和0.2mM5-ALA处理细胞，上述蛋白表达水平及其活性最高。CYP的MOI为5pfu/细胞、POR的MOI为2pfu/细胞时，两者的共表达效率最高。
【技术实现步骤摘要】
【技术保护点】
一种改进细胞色素Ｐ４５０酶家族体外表达的方法，其特征在于在步骤Ｄ所述的辅助因子为如下任意一种：①０．５－６μｇ／ｍｌ Ｈｅｍｉｎ；②０．０５－０．６ｍＭ ５－ＡＬＡ；③０．０１－０．４ｍＭ Ｆｅ↑［３＋］；④０．０５－０．６ｍＭ －ＡＬＡ和０．０１－０．４ｍＭ Ｆｅ↑［３＋］混合物； 具体制备方法如下： Ａ、重组转移载体ｐＦａｓｔＢａｃ１－ＣＹＰｓ／ＰＯＲ质粒的构建与鉴定 双酶消化重组质粒ｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ＰＯＲ和转移质粒载体ｐＦａｓｔＢａｃ↑［ＴＭ］ １ ，经１％琼脂糖凝胶电泳分离后，回收目的片段；用Ｔ４ ＤＮＡ连接酶连接回收的ＰＯＲ基因与载体ｐＦａｓｔＢａｃ １片段，构建重组转移载体质粒ｐＦａｓｔＢａｃ１－ＰＯＲ；经氨苄青霉素抗性平板筛选，获得含重组质粒的大肠杆菌，提取菌液ＤＮＡ，获得重组转移载体质粒ＤＮＡ；使用双酶切消化验证ｐＦａｓｔＢａｃ１－ＣＹＰ２Ａ１３和ｐＦａｓｔＢａｃ１－ＰＯＲ； Ｂ、重组真核表达病毒Ａｃ－Ｂａｃｍｉｄ－ＣＹＰｓ／ＰＯＲ ＤＮＡ的构建与鉴定 将已构建好的ｐＦａｓｔＢａｃ１－ＣＹＰｓ／ＰＯＲ重组质粒转化ＤＨ１０Ｂａｃ大肠杆菌感受态细胞，在ＤＨ１０Ｂａｃ大肠杆菌的助手质粒Ｈｅｌｐｅｒ辅助下经Ｔｎ７转座子转座，将各ＣＹＰｓ／ＰＯＲ的基因片段插入穿梭载体Ｂａｃｍｉｄ中，经卡那霉素、庆大霉素和四环素三抗筛选和蓝白斑筛选，得到重组Ａｃ－Ｂａｃｍｉｄ－ＣＹＰｓ／ＰＯＲ ＤＮＡ，用ＰＣＲ反应进行验证； Ｃ、重组真核表达病毒Ａｃ－Ｂａｃｍｉｄ－ＣＹＰｓ／ＰＯＲ的获得 在６孔板接种９×１０↑［５］个细胞／孔，２７℃贴壁１ｈ；现配杆粒ＤＮＡ与Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ转染试剂复合物对细胞进行转染，２７℃孵育５ｈ后，加入２ｍｌ Ｓｆ－９００ Ⅱ ＳＦＭ培养液含青霉素１００ ＩＵ／ｍｌ；链霉素１００ μｇ／ｍｌ，２７℃孵育７２ｈ或直到看到病毒感染的迹象为止；收取含有目的基因的第一代重组病毒液，再用此病毒液感染Ｓｆ９细胞，收取第二代重组病毒液，可以保存备用或感染Ｓｆ９细胞以得到更高效价的病毒液； Ｄ、重组ＣＹＰ４５０ｓ／ＰＯＲ蛋白的表达 使用重组病毒液感染Ｓｆ９细胞，加入辅助因子，以表达有活性的ＣＹＰ４５０蛋白；感染后７２小时收集细胞，超声破碎细胞，然后差速离心分离出细胞中的微粒体蛋白，分装后－８０℃保存备用；以空载体病毒感染细胞表达的蛋白做阴性对照，进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳，以免疫印迹法检测ＣＹＰ２Ａ１３和ＰＯＲ蛋白的表达，使用扫描仪扫描Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ条带，用Ｉｍａｇｅ Ｊ １．４３软件对条带进行灰度值分析； Ｅ、ＣＯ－差示光谱法检测ＣＹＰ４５０蛋白活性 采用ＣＯ差示光谱法检测ＣＹＰ４５０蛋白酶活性：微粒体悬液用微粒体蛋白稀释缓冲液稀释至１ｍｇ／ｍｌ，取１ｍｌ加入到１ｃｍ光径的比色皿中，然后加入适量的保险粉，用封口膜封口混匀后测定ｂｌａｎｋ，缓慢通入ＣＯ ２分钟，混匀使ＣＯ与微粒体充分接触，然后在紫外分光光度计的ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｓｃａｎ模式下扫描４００ｎｍ至５５０ｎｍ处的吸收光谱，再依据相关公式计算微粒体蛋白中ＣＹＰ４５０蛋白的含量； Ｆ、细胞色素Ｃ分析法检测ＰＯＲ蛋白活力 在１ｃｍ光径的比色皿中加入０．８４ｍｌ的还原酶分析缓冲液，然后加入０．１ｍｌ ０．８ ｍＭ细胞色素Ｃ，再加入２０μｌ稀释适当倍数的微粒体悬液，混匀后测定ｂｌａｎｋ，然后加入５０μｌ ４ｍＭ的ＮＡＤＰＨ，用封口膜封口后，迅速混匀，立即用紫外分光光度计的ｋｉｎｅｔｉｃ／ｔｉｍｅ模式检测３分钟内５５０ｎｍ处的吸光值变化，再依据公式计算还原酶活力。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王守林，陆慧媛，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：84
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