本发明专利技术提供一种小型猪CYP3A22和CYP3A46重组酶的构建表达方法及应用。本发明专利技术通过克隆表达小型猪CYP3A22和CYP3A46基因，获得功能良好的pCYP3A22和pCYP3A46重组酶，并应用于小型猪与人CYP3A的单酶的相似性评价，为药物临床前药代动力学研究提供指导。本发明专利技术提供的重组酶可在临床前药代动力学体外筛选合适的实验动物模型中的应用，通过体外孵育实验考察某经CYP3A代谢药物被小型猪CYP3A和人CYP3A重组酶的代谢情况是否相似，判断该药物的临床前试验是否适合选用小型猪作为其药代动力学研究的动物模型。该体外结果同时可为体内研究提供基础数据及参考依据。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供一种小型猪CYP3A22和CYP3A46重组酶的构建表达方法及应用。本专利技术通过克隆表达小型猪CYP3A22和CYP3A46基因，获得功能良好的pCYP3A22和pCYP3A46重组酶，并应用于小型猪与人CYP3A的单酶的相似性评价，为药物临床前药代动力学研究提供指导。本专利技术提供的重组酶可在临床前药代动力学体外筛选合适的实验动物模型中的应用，通过体外孵育实验考察某经CYP3A代谢药物被小型猪CYP3A和人CYP3A重组酶的代谢情况是否相似，判断该药物的临床前试验是否适合选用小型猪作为其药代动力学研究的动物模型。该体外结果同时可为体内研究提供基础数据及参考依据。【专利说明】小型猪细胞色素P450重组酶的构建表达及应用
本专利技术属生物医药领域，特别涉及小型猪细胞色素P450基因的蛋白重组表达及应用。技术背景细胞色素P450 (cytochrome P450，CYP)是一类含有非共价结合血红素的蛋白，主要位于细胞内质网膜上，在人和动物体内普遍存在。P450酶是人体内重要的药物代谢酶，负责催化内源性物质或外源性物质的I相代谢，参与了接近90%左右的临床药物的代谢。该酶主要存在于肝脏中，在一些肝外组织(如:肺，小肠，肾脏等)中也广泛存在。编码该酶的P450基因是一个基因超家族，含有多个家族和亚家族，其中CYP3A亚家族含量最多，代谢底物谱最广，是人类最主要的药物代谢酶。另外，CYP3A与许多癌症的发生、治疗及预后都密切相关，大大提闻了人们对它的关注程度。新药上市前必须经过临床前动物研究考察药物的安全性和有效性，动物研究能够初步判断药物在体内的药效及药代动力学行为，为药物进行临床试验提供基础数据及重要的参考依据。因此，临床前研究中使用的实验动物需能较好的模拟人体中的情况，才能对后续的人体临床试验产生更好的指导意义。细胞色素P450的差异是实验动物与人药物代谢特性差异的重要原因，其介导的药物代谢对药物的ADME具有重要影响，其介导药物生成代谢产物的种类和转化快慢在很大程度上决定了药物的药代动力学、药效及清除率，决定了药物的有效性和安全性。因此，在药物临床前研究时我们应根据药物性质的不同，尽量选择与人体内ADME代谢特性相似的动物模型。考虑到CYP3A酶在药物代谢中的主导地位，不同实验动物的CYP3A代谢特性就成为动物模型选择的重要依据。随着动物保护运动的兴起，国际动物保护组织对实验动物的限制更加严格，“3R”原则(Reduce, Replace, Refine)逐渐推广，使得灵长类动物及犬等高等动物使用受到限制，以小型猪进行药物的药理、毒理、药代、药效的研究日渐增多。肝微粒体水平的研究表明小型猪与人CYP酶代谢特性相似，其中猪的CYP3A在催化活性及抑制特性上与人最为接近。然而肝微粒体为混合酶系，并不能反应小型猪单酶的代谢特性，本研究通过杆状病毒-昆虫细胞表达系统，能够获得活性良好的小型猪CYP3A家族最主要的单酶CYP3A22和CYP3A46，为体外研究小型猪与人CYP3A的单酶的相似性，以及体外评价小型猪是否适合用作某药物临床前药代动力学研究的实验动物提供理想的工具。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供代谢活性良好的小型猪CYP3A22和CYP3A46重组酶的构建表达方法，通过以下步骤实现:(1)以巴马小型猪的肝cDNA为模板，通过设计CYP3A22和CYP3A46基因的特定引物，获得巴马香猪CYP3A22和CYP3A46基因的编码序列，其核苷酸序列如SEQ ID No: 1、SEQ ID No: 2所示，将该基因片段添A后与pMD18_T连接得pMD18_T/CYP3A22和pMD18_T/CYP3A46质粒，再将其转入大肠杆菌E.coli DH5 α感受态细胞进行质粒扩增。所设计的引物序列如下:SEQ ID No:3CYP3A22 上游引物:ATGGACCTGATCCCAAGCTTSEQ ID No:4CYP3A22 下游引物:TCAGGCTCCACTTACGGTCSEQ ID No:5CYP3A46 上游引物:ATGGACCTGATCCCAGGCTTSEQ ID No:6CYP3A46 下游引物:TCAGGCTCCACTTGTGGTC。(2)以获得的pMD18-T/CYP3A22和pMD18_T/CYP3A46质粒为模板，通过设计含有BamHI, SAlI两个酶切位点的特定引物，获得两端含特定酶切位点的巴马香猪CYP3A22和CYP3A46基因，用BamHI，Sail两个酶进行双酶切得到CYP3A22、CYP3A46两个基因片段。引物序列如下:SEQ ID No:7CYP3A22 h游引物:GCGGATCCCGATGGACCTGATCCCAAGCT,SEQ ID No:8CYP3A22 下游引物:ACGCGTCGACTCAATGATGATGATGATGATGGGCTCCACTTACGGTCC,SEQ ID No: 9CYP3A46 h.游引物:GCGGATCCCGATGGACCTGATCCCAGGCTTTTC,SEQ ID No:10CYP 3A46 上游引物:ACGCGTCGACTCAATGATGATGATGATGATGGGCTCCACTTGTGGTCC。(3)将载体质粒pFastBacl也用同样的两个酶双酶切，得到含有与上述两个基因片段相同酶切位点的载体片段，通过T4连接酶分别将CYP3A22、CYP3A46基因片段与载体片段连接，构建 pFastBac-CYP3A22，pFastBac_CYP3A46 两种质粒。(4)再将质粒转化入E.coli DHlOBac感受态细胞进行转座，获得Bacmid_CYP3A22和Bacmid-CYP3A46重组粘粒。将重组粘粒别转染草地夜蛾卵巢细胞(Sf9)，获得重组病毒V-CYP3A22和V-CYP3A46，再分别将以上两种重组病毒与v-CYPOR和v_CYPb5共感染Sf9细胞，即可在细胞内高表达CYP3A22和CYP3A46重组蛋白；通过Western Bolt验证重组蛋白的表达，通过CYP3A经典底物睾酮和咪达唑仑验证CYP3A22和CYP3A46活性。本专利技术的另一个目的是提供该小型猪CYP3A22和CYP3A46重组酶在临床前药代动力学体外筛选合适的实验动物模型中的应用。本专利技术的用途通过以下步骤实现:(1)以研究药物作为底物，分别与PCYP3A22/46孵育，检测该药物经pCYP3A22/46代谢生成的代谢产物种类及相对含量，将该结果与hCYP3A4/5的结果进行比较，若生成的主要代谢产物和相对含量较为一致，则小型猪与人CYP3A代谢该药物的代谢物谱相似；(2)将系列浓度的研究药物分别与PCYP3A22/46孵育，绘制酶动力学曲线，通过GraphPad Prism5软件计算米氏常数Km、最大反应速率Vmax、和内在代谢清除率Clint (Vmax/Km)等酶动力学参数,将所得结果与hCYP3A4/5的结果进行比较，若软件拟合所得的酶动力学参数相近，则可以说明小型猪与人CYP3A对该药物的亲和力和转化速率相近。综合以上结果，小型猪与人CYP3A对该药物的代谢特性相近，则可以推断该药物的临床前药代动力学研究适合选用小型猪作本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种小型猪CYP3A22和CYP3A46重组酶的构建表达方法，其特征在于，通过以下步骤实现：（1）以巴马小型猪的肝cDNA为模板，通过设计CYP3A22和CYP3A46基因的特定引物，获得巴马香猪CYP3A22和CYP3A46基因的编码序列，其核苷酸序列如SEQ?ID?No:1、SEQ?ID?No:2所示，将该基因片段添A后与pMD18?T连接得pMD18?T/CYP3A22和pMD18?T/CYP3A46质粒，再将其转入大肠杆菌E.coli?DH5α感受态细胞进行质粒扩增；所述引物序列如下：SEQ?ID?No:3?CYP3A22上游引物：ATGGACCTGATCCCAAGCTT，SEQ?ID?No:4?CYP3A22下游引物：TCAGGCTCCACTTACGGTC，SEQ?ID?No:5?CYP3A46上游引物：ATGGACCTGATCCCAGGCTT，SEQ?ID?No:6?CYP3A46下游引物：TCAGGCTCCACTTGTGGTC；（2）以获得的pMD18?T/CYP3A22和pMD18?T/CYP3A46质粒为模板，通过设计含有BamHI，SAlI两个酶切位点的特定引物，获得两端含特定酶切位点的巴马香猪CYP3A22和CYP3A46基因，用BamHI，SalI两个酶进行双酶切得到CYP3A22、CYP3A46两个基因片段；引物序列如下：SEQ?ID?No:7?CYP3A22上游引物：GCGGATCCCGATGGACCTGATCCCAAGCT，SEQ?ID?No:8?CYP3A22下游引物：ACGCGTCGACTCAATGATGATGATGATGATGGGCTCCACTTACGGTCC，SEQ?ID?No:9?CYP3A46上游引物：GCGGATCCCGATGGACCTGATCCCAGGCTTTTC，SEQ?ID?No:10?CYP3A46上游引物：ACGCGTCGACTCAATGATGATGATGATGATGGGCTCCACTTGTGGTCC；（3）将载体质粒pFastBac1也用同样的两个酶双酶切，得到含有与上述两个基因片段相同酶切位点的载体片段，通过T4连接酶分别将CYP3A22、CYP3A46基因片段与载体片段连接，构建pFastBac?CYP3A22，pFastBac?CYP3A46两种质粒；（4）再将质粒转化入E.coliDH10Bac感受态细胞进行转座，获得Bacmid?CYP3A22和Bacmid?CYP3A46重组粘粒；（5）将重组粘粒别转染草地夜蛾卵巢细胞（Sf9），获得重组病毒v?CYP3A22和v?CYP3A46，再分别将以上两种重组病毒与v?CYPOR和v?CYPb5共感染Sf9细胞，即在细胞内高表达CYP3A22和CYP3A46重组蛋白；通过Western?Bolt验证重组蛋白的表达，通过CYP3A经典底物睾酮和咪达唑仑验证CYP3A22和CYP3A46活性。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：边诣聪，魏泓，余露山，商海涛，曾苏，郭科男，马利萍，刘宇，郑小丽，姚青青，
申请(专利权)人：浙江大学，中国人民解放军第三军医大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。