与细胞色素P450酶共表达的细胞模型构建及应用制造技术

本发明专利技术提供一种与细胞色素P450酶共表达的细胞模型构建，将CYPA3A4的表达质粒pcDNA3.1-Hygro-CYP3A4转染MDCK-mock，MDCK-hOCT1细胞，经潮霉素及G418抗性筛选，获得具有稳定抗性的单克隆细胞，通过westernblot检测CYP3A4的蛋白表达，获得稳定单表达CYP3A4及稳定共表达CYP3A4，hOCT1的细胞，用经典底物及抑制剂进行功能验证。本发明专利技术建立的细胞模型可以用于细胞水平专属性研究CYP3A4的作用，及研究hOCT1及CYP3A4的共同作用，预测药物在肝脏的处置情况，预测可能由CYP3A4,hOCT1介导的药物相互作用。本发明专利技术设计合理，专属性和重复性好。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种与细胞色素P450酶共表达的细胞模型构建，其特征在于，通过以下步骤实现：设计含有KpnⅠ，XhoⅠ两个酶切位点的引物，引物序列如SEQ?ID?No:?1，2所示，将终止密码子之前带有组氨酸标签的人CYP3A4?cDNA克隆于载体质粒pcDNA3.1(+)?Hygro上，构建表达质粒pcDNA3.1(+)?Hygro?CYP3A4，表达质粒转染MDCK?pcDNA3.1(+)及MDCK?hOCT1细胞，转染后通过氨基糖苷类抗生素G418及潮霉素B进行抗性筛选，挑选单克隆细胞，单克隆细胞进行western?blot验证?CYP3A4的蛋白表达，得到稳定表达CYP3A4的MDCK?CYP3A4及MDCK?hOCT1?CYP3A4细胞，并通过Western?blot从中挑选出CYP3A4蛋白表达量一致的细胞，提取总RNA，通过引物序列如SEQ?ID?No:?4?9所示的特定引物进行Real?time?PCR验证细胞中CYP3A4及hOCT1的mRNA表达，并与空载体细胞及MDCK?hOCT1进行比较，进而以P450?Glo??CYP3A4?Assay试剂盒检测CYP3A4活性，并考察酮康唑对代谢活性的影响，从而确认转染细胞CYP3A4的功能；应用hOCT1荧光底物4?(4?(dimethylami?no)styryl)?N?methylpyridinium，结合hOCT1抑制剂四乙胺验证细胞hOCT1的功能；其中人CYP3A4?cDNA的核苷酸序列如SEQ?ID?No:?3所示。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋惠娣，涂美娟，李丽萍，郑世瑞，陈忠坚，孙思源，周慧，曾苏，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：