一种基因工程菌及其构建方法与生产香兰素的方法技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，公开了一种基因工程菌及其构建方法与生产香兰素的方法。本发明专利技术所述基因工程菌对3‑脱氢莽草酸代谢途径进行改造，缺失了莽草酸脱氢酶编码基因，同时缺失了香兰素降解相关基因，使菌株累积大量的3‑脱氢莽草酸，并增强了3‑脱氢莽草酸脱水酶基因、O‑甲基转移酶基因和香草酸还原酶基因以及3‑脱氢莽草酸代谢途径的2个基因的表达，从而增加香兰素的产量，同时减少香兰素的降解，使发酵液中香兰素的量增多，进而提高菌株发酵产香兰素的能力。实验表明，本发明专利技术所述基因工程菌利用葡萄糖或甘油为底物生产香兰素，香兰素产量明显提高。而且采用本发明专利技术的方法发酵产生的香兰素发酵液中无异香兰素杂质，便于后续分离。

Gene engineering bacterium and construction method thereof and method for producing vanillin

The invention belongs to the technical field of biological engineering, discloses a gene engineering bacterium and a construction method thereof and a method for producing vanillin. The genetic engineering bacteria for the transformation of the 3 3-Dehydroshikimic acid metabolic pathway, lack of shikimate dehydrogenase encoding gene, and the deletion of vanillin degradation related genes, the strain accumulated large amounts of 3 3-Dehydroshikimic acid, and enhanced the expression of metastasis in 3 3-Dehydroshikimic acid dehydratase gene, O methyltransferase gene and vanillic acid reductase genes and 3 pathways 3-Dehydroshikimic acid metabolism 2 genes, thereby increasing the yield of vanillin, vanillin and reduce the degradation of the vanillin in fermentation broth increased, thus improving the ability of vanillin fermentation. The experiment shows that the gene engineering bacteria can produce vanillin by using glucose or glycerin as substrate, and the yield of vanillin can be improved obviously. Moreover, the vanillin fermentation liquid produced by the method of the invention is no more than vanillin impurity, which is convenient for subsequent separation.

【技术实现步骤摘要】
一种基因工程菌及其构建方法与生产香兰素的方法
本专利技术属于生物工程
，具体地说涉及一种基因工程菌及其构建方法与生产香兰素的方法，尤其是一种生产香兰素的基因工程菌及其构建方法与利用该菌株以葡萄糖、甘油等廉价碳源生产香兰素的方法。
技术介绍
香兰素(Vanillin)，又名香草醛，化学名为3-甲氧基-4-羟基苯甲醛，为白色或微黄色结晶，具有香荚兰香气及浓郁的奶香，是人们普遍喜爱的奶油香草香精的主要成分。香兰素是目前世界上产量最大的合成香料。香兰素的合成方法主要有化学合成法和微生物转化法。其中化学合成法产率高，成本低，但存在着原料愈创木酚等有毒、环境污染较严重，产品不具备天然性等问题。近年来，随着生物学，尤其是合成生物学的迅速发展，微生物法制备香料因反应条件温和，能保持食品的天然性而越来越受关注。利用微生物转化法生产天然香兰素方面的研究已取得了很多重要的研究成果，但仍存在许多科学问题需要深入的探索研究，而且高效益的工业化生产也亟待进一步的优化。现有的研究中，多以阿魏酸、丁香酚、异丁香酚等原料为底物，通过生物催化或生物转化法生产香兰素。然而这些原料存在成本高、来源复杂及毒性等不足之处本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因工程菌，其特征在于，所述菌株中一个或多个与3‑脱氢莽草酸代谢途径相关的基因被突变，并且/或者一个或多个与3‑脱氢莽草酸代谢途径相关的基因被敲除或失活，并且/或者一个或多个与香兰素代谢相关的基因被敲除或失活，并且/或者一个或多个与3‑脱氢莽草酸代谢途径相关的基因表达被增强，并且/或者一个或多个与香兰素生产途径相关的基因表达被增强。

【技术特征摘要】
1.一种基因工程菌，其特征在于，所述菌株中一个或多个与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因被突变，并且/或者一个或多个与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因被敲除或失活，并且/或者一个或多个与香兰素代谢相关的基因被敲除或失活，并且/或者一个或多个与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因表达被增强，并且/或者一个或多个与香兰素生产途径相关的基因表达被增强。2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述被突变的与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因为aroFfbr、aroGfbr或aroHfbr中至少一个；所述被敲除或失活的与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因为aroE；所述被敲除或失活的与香兰素代谢相关的基因为yqhC、yqhD、dkgA、yahK或yjgB中至少一个；所述被过表达的与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因为aroFfbr和/或aroB；所述被过表达的与香兰素生产途径相关的基因为3-脱氢莽草酸脱水酶基因aroZ，O-甲基转移酶基因comt或香草酸还原酶基因car中至少一个。3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述被突变的与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因为aroFfbr的148位脯氨酸突变成亮氨酸；所述被敲除或失活的与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因为aroE；所述被敲除或失活的与香兰素代谢相关的基因为yqhC、yqhD、dkgA、yahK和yjgB；所述被过表达的与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因为aroFfbr和aroB；所述被过表达的与香兰素生产途径相关的基因为aroZ、comt和car。4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述代谢工程菌保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2016770。5.一种重组载体，其特征在于，pRSFDuet-1载体的多克隆位点插入3-脱氢莽草酸脱水酶基因和O-甲基转移酶基因。6.一种重组载体，其特征在于，pETDuet-1载体的多克隆位点插入香草酸还原酶基因。7.一种重组载体，其特征在于，pACYCDuet-1载体的多克隆位点插入aroB和aroFfbr基因，其中所述aroFfbr基因中148位脯氨酸突变成亮氨酸。8.权利要求1所述基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：A、敲除或失活菌株中一个或多个与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因，获得工程菌株Ⅰ；并且/或者B、敲除或失活菌株中一个或多个与香兰素代谢相关的基因，获得工程菌株Ⅱ；并且/或者C、突变菌株中一个或多个与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因，获得工程菌株Ⅲ；D、增强菌株中一个或多个与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因的表达，获得重组载...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴艳，王元彩，李斌，
申请(专利权)人：波顿上海生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31