一种初步筛选次生代谢产物产生菌的方法技术

本发明专利技术公开了初步筛选次生代谢产物产生菌的方法。该方法包括以下步骤：１）测定待筛选的菌种库中的每个菌株的核糖体小亚基ＲＮＡ基因片段的序列；２）将目标次生代谢产物的已知产生菌，或在分子分类学上与所述目标次生代谢产物的已知产生菌是同一个分类阶元的菌株作为参照菌株；以所述参照菌株的核糖体小亚基ＲＮＡ基因片段序列作为参照核糖体小亚基ＲＮＡ基因片段序列；将所述参照核糖体小亚基ＲＮＡ基因片段序列与步骤１）中的所述待筛选的菌种库中的菌株的核糖体小亚基ＲＮＡ基因片段序列进行一对一的同源性比对，和所述参照核糖体小亚基ＲＮＡ基因片段序列的同源性大于等于根据筛选通过率确定的同源性数值的菌株即为初筛的嫌疑菌株。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及。
技术介绍
微生物产生的次生代谢产物在人类生活中得到了广泛应用。最典型的莫过于1929年A.Fleming博士发现青霉素，经历了半个多世纪，青霉素不但得到了广泛的应用，而且有了许多重要发展，经久不衰。目前筛选次生代谢产物产生菌的方法很多，但是大部分可归为两大类。一类是直接根据待筛化合物的理化性质建立筛选方法和流程，如用液相色谱、薄层层析等层析的方法进行菌种发酵液的初筛，然后对初筛得到的嫌疑菌株用包括质谱、紫外光谱、红外光谱和核磁共振等在内的方法进行进一步的筛选和鉴定，最终确定嫌疑菌株产生的是否为目标次生代谢产物。如果待筛选菌株产生的的目标化合物具有比较容易检测的生物活性，可以采用第二类筛选方法，即在第一类方法中整合进基于生物活性检测方法的筛选流程。 为了建立快速而有效的次生代谢产物产生菌筛选方法，或者称之为筛选流程，初筛方法的选择十分关键初筛速度和效率往往决定了整个筛选的速度和效率。这是因为，次生代谢产物产生菌的筛选往往基于一个小到几千，大到十几万菌种的菌种库，所以通过初筛手段快速准确的挑出嫌疑菌株，大大缩小筛选范围是提高筛选速率的关键。专利CN1258743A专利技术的是一种快速筛选产醇腈酶微生物的方法，专利US 4,568,638专利技术的是一种筛选葡萄糖-2-氧化酶产生菌的方法，这两种方法都采用了生物活性检测方法作为初筛的手段，其关键点也都是如何建立快速有效的生物活性筛选方法。随着分子生物学方法的普及和广泛应用，一些筛选方法开始采用分子生物学技术作为筛选手段。专利02125509.1(公开号CN 1398986A)介绍了一种通过检测待筛菌株中是否含有目标抗生素合成基因的方法，作为初筛手段，来筛选目标抗生素产生菌。 虽然以上方法大大提高了筛选速度和/或准确率，有些也明显降低了相对筛选成本。然而，以上介绍的所有类型的筛选方法的筛选速度，还是不够快，特别是当基于一个大的菌种库筛选多种次生代谢产物时。 当筛选得到目标次生代谢产物产生菌后，为了作进一步的研究开发，特别是做进一步的科学研究、菌种选育和发酵生产，一般需要进行产生菌的菌种鉴定，即鉴定该菌种在微生物分类学上的位置，一般来讲，大多是鉴定该菌株的属、种甚至亚种。传统的菌种鉴定方法从形态特征和生理生化特征上进行。然而，分子分类学方法在菌种分类学鉴定上得到了广泛的应用，目前已经成为相对独立的分类学鉴定方法。最常用的分子分类学方法是基于核糖体小亚基RNA基因(SmallSubunit Ribosomal RNA Gene，SSU rRNA基因)编码区进行序列比对，或者利用位于SSU rRNA基因编码区3’和下游邻近的核糖体大亚基RNA基因(Large SubunitRibosomal RNA Gene，LSU rRNA基因)编码区5’之间的序列进行序列比对。SSUrRNA基因，对于原核细胞来讲，就是16s rRNA基因，对于真核细胞来讲，就是18srRNA基因。SSU-LSU rRNA基因编码区间的序列，对于原核细胞而言，就是16S～23S rRNA基因编码区间序列；对于真核细胞而言，就是18S～28S rRNA基因编码区间的序列。为了方便起见，这里所说的SSU rRNA基因，不仅仅包括SSU rRNA基因编码区，而且包括下游紧挨的SSU-LSU rRNA基因编码区间的序列。基于核糖体RNA(rRNA)序列分析的分子分类学方法建立在如下基本事实上分类学上越相近的物种，其rRNA基因序列的相似性越强；分类学上相隔越远的物种，其rRNA序列相似性越差。目前已经有了成熟的，进行序列比对和同源性分析的成熟实用的软件。利用这类软件，将未知菌株的上述序列跟大量已知种属的菌株的对应序列进行比对，并利用专门的软件进行亲缘关系分析，就可以比较准确的确定未知菌株在分类学上的位置。目前这类软件非常多，如Mega和Phylip等，并且可以利用庞大的互联网基因数据库，如Genebank进行在线分析，十分方便。一般而言，基于SSU rRNA基因序列进行分子分类学分析，可以将未知菌株确定到属、种，甚至亚种和菌株的水平。 目前，基于SSU rRNA序列的分子生物学技术主要用于各种用途的鉴定工作，如在微生物制药领域用于菌种分类学鉴定，在疾病检测领域用于特殊致病菌的检测。美国专利申请20040110247介绍了一种基于rRNA和rRNA基因检测微生物的存在和存活状态的方法，通过检测rRNA基因，可以检测微生物是否在样品中存在过，而通过定量检测rRNA的量，则可以检测微生物的数量。 在多年的次生代谢产物产生菌筛选和随后的菌种鉴定工作中，人们早就发现，某种特定的次生代谢产物产生菌往往局限在少数几个属，或者某个属中的几个种内，即，某种特定次生代谢产物产生菌具有一定程度上的分类学特异性。分类学上相差较远的菌，产生相同抗生素的可能性较小(Giancarlo Lancini等编著 王以光主译，《抗生素—多学科研究入门》，1998年，人民卫生出版社)。如，到目前为止，发现的10,000种微生物来源的生理活性物中，三分之二来源于放线菌，其次是真菌，以及细菌中有限的几个属。放线菌产生的活性物质，其中的链霉菌又占了大部分(《微生物制药》，吴剑波主编，2002年12月第一版，化学工业出版社)。又如，发现的青霉素产生菌绝大多数是青霉属，少数是曲霉属；目前发现的灰黄霉素的产生菌则均为青霉属；已发现的埃博霉素(Epothilones)的产生菌目前仅限于黏细菌中的纤维堆囊菌(Sorangium Cellulosum)(《抗生素与微生物产生的生物活性物质》，张致平和姚天爵主编，2005年1月第一版，化学工业出版社)。也有一些次生代谢产物产生菌的属种分布非常广，如青霉素产生菌有青霉属下的20多个种和曲霉属下几个种，高产菌则往往集中于产黄青霉等青霉属下的少数几个种。 需要说明的是，次生代谢产物产生菌并没有非常严格的属种专一性，这种属种相对专一性分布是长期以来实践中的统计学分析结果(Giancarlo Lancini等编著 王以光主译，《抗生素—多学科研究入门》，1998年，人民卫生出版社)。尽管如此，这些统计学分析结果可以为实际筛选工作提供重要的指导如果已经知道某种次生代谢产物产生菌的分类学类别，先从库中初步筛选在分类学上属于同一类别，或者比较相近的菌株，然后进行进一步筛选，往往能够大大缩短筛选周期和提高筛选效率。 目前这种次生代谢产物产生菌的属种相对专一性特点也被人们用于指导实际筛选工作。如人们在筛选某种特定次生代谢产物前，有时会根据文献报导的产生菌的属种相对特异性从菌种库中挑出特定属或种的菌株，然后再根据目标产物的理化或者生物学活性进行筛选。这种挑选一般是基于形态特征观察，而且由于没有量化、准确和便于快速鉴别的指标，而且也缺乏效率，费时费力，不适合菌种库容量达到几万菌株的大规模筛选。目前，还没有一种方法，将这种菌种分类学上的信息用于高通量筛选已知的次生代谢产物产生菌。 综上所述，针对几千甚至几万菌种容量的大菌种库进行大规模筛选，需要高通量的筛选方法来进行高效筛选，才可能大大缩短筛选周期，节约筛选成本。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种快速、有效的初步筛选次生代谢产本文档来自技高网...

【技术保护点】
初步筛选次生代谢产物产生菌的方法，包括以下步骤：１）测定待筛选的菌种库中的每个菌株的核糖体小亚基ＲＮＡ基因片段的序列；２）将目标次生代谢产物的已知产生菌，或在分子分类学上与所述目标次生代谢产物的已知产生菌是同一个分类阶元的菌 株作为参照菌株；以所述参照菌株的核糖体小亚基ＲＮＡ基因片段序列作为参照核糖体小亚基ＲＮＡ基因片段序列；将所述参照核糖体小亚基ＲＮＡ基因片段序列与步骤１）中的所述待筛选的菌种库中的菌株的核糖体小亚基ＲＮＡ基因片段序列进行一对一的同源性比对，和所述参照核糖体小亚基ＲＮＡ基因片段序列的同源性大于等于根据筛选通过率确定的同源性数值的菌株即为初筛的嫌疑菌株。

【技术特征摘要】
1.初步筛选次生代谢产物产生菌的方法，包括以下步骤1)测定待筛选的菌种库中的每个菌株的核糖体小亚基RNA基因片段的序列；2)将目标次生代谢产物的已知产生菌，或在分子分类学上与所述目标次生代谢产物的已知产生菌是同一个分类阶元的菌株作为参照菌株；以所述参照菌株的核糖体小亚基RNA基因片段序列作为参照核糖体小亚基RNA基因片段序列；将所述参照核糖体小亚基RNA基因片段序列与步骤1)中的所述待筛选的菌种库中的菌株的核糖体小亚基RNA基因片段序列进行一对一的同源性比对，和所述参照核糖体小亚基RNA基因片段序列的同源性大于等于根据筛选通过率确定的同源性数值的菌株即为初筛的嫌疑菌株。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1)和2)中所述核糖体小亚基RNA基因片段为选自下述a)、b)或c)中的一段长度大于等于100个核苷酸或100个核苷酸对的连续的多核苷酸序列a)核糖体小亚基RNA基因编码区序列，b)SSU-LSUr RNA基因编码区间的序列，c)核糖体小亚基RNA基因编码区和SSU-LSUr RNA基因编码区间的序列；所述SSU-LSU rRNA基因编码区间的序列是指位于核糖体小亚基RNA基因编码区的3’末端和下游邻近的核糖体大亚基RNA基因编码区5...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭晶生，
申请(专利权)人：彭晶生，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]