本发明专利技术涉及一种用于毛细管电泳ＤＮＡ测序的聚合物／金纳米粒子复合介质及其制备方法，属于ＤＮＡ测序及分离生物技术领域；用于ＤＮＡ测序的聚合物／金纳米粒子复合介质的缓冲溶液浓度是２．０％～３．０％；主要经过以下步骤制备：（１）具有自涂敷功能准互穿聚合物网络的合成；（２）Ａｕ纳米粒子的制备；（３）准互穿聚合物网络／金纳米粒子复合介质的合成。本发明专利技术复合介质在一定的浓度下粘度降低，便于注入和冲出毛细管，由于自涂敷功能聚合物的存在，无需预先涂敷毛细管内壁，就可以预防电渗流的产生，省却了涂敷毛细管内壁这一步骤，大大简化了制柱过程，减少了毛细管的使用成本，增加了毛细管的使用寿命。本发明专利技术主要用于毛细管电泳分离与ＤＮＡ测序。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于毛细管电泳DNA测序的聚合物/金纳米粒子复合介质及其制备方法，属于DNA测序及分离生物
技术介绍
毛细管电泳是进行DNA分析行之有效的方法。对于毛细管电泳来说，由于分离介质决定着DNA碎片的迁移行为和分离度，因而它是DNA分离的一个重要因素，目前合成高分子是DNA分离中用的最广泛的分离介质，对于一个有效的分离介质来说，应该同时具备高的筛分能力、低粘度和自涂敷功能。常用于分离DNA的合成聚合物主要有亲水的均聚物(Heller C.，Electrophoresis，2001，22629-643)，对这些均聚物来说，大部分需要对毛细管内壁进行涂敷以除去电渗流，其中只有PEO(聚环氧乙烷)、PDMA(聚N，N-二甲基丙烯酰胺)、PVP(聚乙烯基吡咯烷酮)等少数聚合物有自涂敷的功能。相比较而言，目前均聚物中高分子量线性聚丙烯酰胺(LPA)的分离效果最好，但是它没有自涂敷功能，且在DNA测序的浓度下粘度也较高，因此导致自动装柱困难。为了解决这一问题，wang等(Wang Y，Liang D，Ying Q，.Chu B，Electrophoresis，2005，26126-136)对上述方法进行了改进，在高分子量的LPA水溶液内引发聚合DMA(N，N-二甲基丙烯酰胺)得到准互穿聚合物网络(quasi-IPN)，调节AA(丙烯酰胺)与DMA的比率发现，在提供足够涂敷能力条件下DMA含量越少分离效率越好。但是这种方法所使用的介质中LPA的分子量(～107)太高，当以一定的浓度溶解在缓冲溶液中时，高分子量的LPA容易降解其使用寿命(≤4个月)受到了很大的影响，另外，由于分子量太高，导致粘度太高，因此需要使用高压系统注入或冲出毛细管，一方面增加了分析成本，另一方面难以实现筛分介质的自动化更换。具有较高筛分能力和较长DNA读出长度的高分子溶液通常粘度也较高，因此，寻求具有高筛分能力的低粘度筛分介质仍是DNA高效分离的重要课题。近年来，在低粘度高分子溶液中加入各种添加剂(如多羟基化合物、粘土、金纳米粒子、乳胶粒等)经证明是非常有效和简单的方法，在添加剂存在下筛分介质可以在较低浓度下就达到高浓度(无添加剂)时的筛分能力，成为不增加粘度而提高分离能力的有效途径。Huang等人(Huang MF，Huang CC，Chang HT.Electrophoresis，2003，242896-2902)提出用含有GNPs(金纳米粒子)的PEO溶液作为分离介质来分离dsDNA(双链DNA)片段，为了避免毛细管壁与DNA的相互作用，用5.0％PVP对毛细管进行了动态涂敷。由于粘度极低(＜15cP)，很容易进行筛分介质的自动更换，研究表明，含GNPs的PEO用于dsDNA分离时具有以下优点快速、分离能力高、重现性好及易于填充毛细管。但是也由于粘度极低，这种介质不能对DNA进行排序。
技术实现思路
本专利技术结合反相乳液聚合和溶液聚合法合成具有分离功能的亲水聚合物和自涂敷功能的聚合物组成的准互穿聚合物网络，然后将金纳米粒子引入此聚合物中。本专利技术的目的是提供一种用于毛细管电泳DNA测序的聚合物/金纳米粒子复合介质，此种复合介质在空毛细管中、较低的粘度下，可以对DNA碱基进行排序，溶于缓冲溶液中的复合介质的使用寿命延长，省去了涂敷毛细管内壁这一步骤，大大简化了制柱过程；金纳米粒子可在准互穿聚合物网络中形成物理交联点，加强了分离过程中形成的聚合物网络的有效性，弥补了分离介质聚合物分子量不太高的缺陷，从而使得到的分离介质达到低粘度、具有自涂敷功能，又能形成高效的聚合物网络，提高DNA分离和DNA测序的速率和效率。本专利技术的另一个目的是提供一种用于毛细管电泳DNA测序的聚合物/金纳米粒子复合介质的制备方法。实现本专利技术的技术方案本专利技术提供一种用于毛细管电泳DNA测序的聚合物/金纳米粒子复合介质，由准互穿聚合物网络和金纳米粒子组合而成，其特征在于线形聚丙烯酰胺的粘均分子量0.9×106～3.5×106Da，丙烯酰胺∶N，N-二甲基丙烯酰胺＝10∶1～100∶1(摩尔比)，Au的直径为10～65nm，每克聚合物/金纳米粒子复合介质中Au含量为20～1200μg，用于DNA测序的聚合物/金纳米粒子复合介质的缓冲溶液浓度是2.0％～3.0％，其中优选线形聚丙烯酰胺的粘均分子量为3.0×106Da。该复合介质由以下方法制备而成(1)具有自涂敷功能准互穿聚合物网络(quasi-IPN)的合成准互穿聚合物网络是非交联的两种聚合物相互贯穿组成的聚合物网络，而互穿聚合物网络是指两种或两种以上交联聚合物相互贯穿而形成的交织聚合物网络。首先用反相乳液聚合的方法在煤油、Span-80、水体系中，用过硫酸铵(APS)/四甲基乙二胺(TEMED)引发丙烯酰胺(AM)得到线形聚丙烯酰胺(LPA)。在整个反应体系中各组份所占的质量百分比水为31～37％、煤油为37～43％、AM为20～26％、Span-80为2～3％、APS为0.002～0.008％，TEMED为0.002～0.005％。具体反应步骤如下量取定量Span-80溶于适量煤油中，通氮气除氧，机械搅拌500rpm。称取定量丙烯酰胺溶于适量去离子水，待完全溶解后得到无色透明溶液，用滴液漏斗逐滴滴入四颈瓶中，体系最先呈现乳浊液状态，随后逐渐变成乳白色。连续通氮气除氧1小时后，升温，用微型注射器分别加入适量APS水溶液和TEMED，反应16～30小时。待反应结束后，在搅拌下将反应物滴入大量丙酮，得到白色沉淀，室温下真空干燥，然后将产物再溶于水中，以丙酮沉淀，抽滤，得到的产物室温下真空干燥，如此重复三次，得到产物聚丙烯酰胺，由乌氏粘度计确定产物的特性粘数(0.1mol/L NaCl水溶液，30℃)，再通过Mark-Houwink公式计算产物的粘均分子量Mv＝9.33×10-3Mv0.75(mL/g)然后在聚丙烯酰胺的水溶液中加入具有自涂敷功能的单体(如DMA等)，用氧化-还原引发的方式进行聚合得到具有自涂敷功能的准互穿聚合物网络。具体反应步骤如下在四颈瓶中加入聚丙烯酰胺水溶液，机械搅拌50rpm，通入氮气除体系内氧气。除氧1小时后用注射器加入适量的N，N-二甲基丙烯酰胺，继续通氮气十分钟后用微型注射器加入适量的的APS水溶液和TEMED，0℃下反应24小时。待反应结束后，在搅拌下将反应物滴入大量丙酮，得到白色沉淀，用丙酮浸泡、抽滤、洗涤，连续数次，将得到的固体置于真空烘箱中，室温下真空干燥至恒重。AM和DMA的配比由核磁共振氢谱(1H-NMR)确定；(2)Au纳米粒子的制备制备所需的玻璃器皿均需用王水清洗，然后用去离子水冲洗并干燥。在装有冷凝管的圆底烧瓶中加入适量的HAuCl4水溶液，在剧烈搅拌下加热该溶液至沸腾。快速将适量的柠檬酸钠水溶液加入到上述沸腾溶液中，该溶液颜色迅速从淡黄色变为蓝色，然后变为紫红色，表明生成了金纳米粒子(GNPs)。继续沸腾10min后，移除热源。溶胶接着搅拌15min后冷却至室温。GNPs的大小可通过透射电镜测得。(3)准互穿聚合物网络/金纳米粒子复合介质的合成将上述Au溶胶分别加入适量的quasi-IPN水溶液中。完全混合均匀后，用过量丙酮沉淀这种溶液，过滤并真空干燥，得本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于毛细管电泳ＤＮＡ测序的聚合物／金纳米粒子复合介质，由准互穿聚合物网络和金纳米粒子组合而成，其特征在于线形聚丙烯酰胺的粘均分子量：０．９×１０↑［６］～３．５×１０↑［６］Ｄａ，丙烯酰胺：Ｎ，Ｎ－二甲基丙烯酰胺＝１０∶１～１００∶１（摩尔比），Ａｕ的直径为１０～６５ｎｍ，每克聚合物／金纳米粒子复合介质中Ａｕ含量为２０～１２００μｇ，用于ＤＮＡ测序的聚合物／金纳米粒子复合介质的缓冲溶液浓度是２．０％～３．０％。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王延梅，周丹，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：34[中国|安徽]
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