一种高产酰基高丝氨酸内酯酶的工程菌及其在循环冷却水系统中的应用技术方案

本发明专利技术属于生物学技术领域，具体涉及一种高产酰基高丝氨酸内酯酶的工程菌及其在循环冷却水系统中的应用。所述高产酰基高丝氨酸内酯酶的工程菌，以E.coli Arctic Express

Engineering bacterium with high production of acyl serine lactone and its application in circulating cooling water system

The invention belongs to the technical field of biology, in particular to an engineering bacterium with high production of acyl serine lactone and its application in the circulating cooling water system. The engineering bacteria yield AIIa, with E.coli Arctic Express

【技术实现步骤摘要】
一种高产酰基高丝氨酸内酯酶的工程菌及其在循环冷却水系统中的应用
本专利技术属于生物学
，具体涉及一种高产酰基高丝氨酸内酯酶的工程菌及其在循环冷却水系统中的应用。
技术介绍
工业用水约占城市用水的80％，而其中冷却用水又约占工业用水的80％，提高冷却用水的重复利用率，节能减排是目前工业用水的通用方法。但由于循环冷却水的温度、pH值适宜多种微生物的生长，随着空气中的微生物不断进入循环冷却水系统，微生物大量繁殖带来了生物粘泥、腐蚀、结垢、换热效率降低等一系列危害。传统抑制微生物污染的物理化学法会带来二次污染，因此，寻求一种有效且绿色环保的抑制循环冷却水系统微生物污染的方法具有重要的意义。群体感应(Quorumsensing，简称为QS)是细菌根据种群密度大小进行种内或种间的一种基因调控机制，这有助于单细胞细菌在复杂多变的环境中增加生存机会。细菌通过分泌并释放一类叫做自诱导物(Autoinducer)的小分子来进行种内和种间的交流，自诱导物又称信号分子(Signalmolecule)。信号分子浓度随细菌种群密度的增加而增加。当信号分子在体系中的浓度达到一定阈值时，则会激活某些特定基因的表达从而实现细菌种内或种间的一些群体行为，如生物发光、生物膜的形成、致病基因的表达、色素的产生、抗生素的合成等，细菌的QS系统在微生物学、医学、环境微生物学等领域都扮演着重要的角色。有研究报道循环水系统中信号分子浓度与微生物污染程度成正比，这意味着通过调节信号分子浓度来缓解微生物污染是可行的。近年来，已有将细菌群体淬灭效应用于抑制微生物污染的研究报道，但现有的群体淬灭细菌，群体感应淬灭酶的表达低，抑制活性不高，无法实现工业化应用；且专利技术人对循环冷却水系统中的微生物抑制效果研究发现，现有的群体感应淬灭菌对循环水系统中的浮游微生物抑制效果不明显，目前尚未见到群体淬灭细菌应用于循环冷却水处理领域的报道。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种高产酰基高丝氨酸内酯酶AiiA的工程菌，所述工程菌能够在培养过程中高产率地产生AiiA，且培养后上清液投加入循环冷却水系统中能抑制其中的微生物污染，尤其是对其中存在的大量浮游微生物抑制效果明显。本专利技术的第二个目的是提供本专利技术工程菌在抑制循环冷却水系统中微生物污染的用途。为实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：一种高表达酰基高丝氨酸内酯酶的工程菌，以E.coliArcticExpressTM(DE3)为表达载体，整合有aiiA目的基因。根据本专利技术的高产酰基高丝氨酸内酯酶的工程菌，所述的aiiA目的基因序列的序列号为DQ440581.1。根据本专利技术的高产酰基高丝氨酸内酯酶的工程菌，其构建方法包括以下步骤：(1)PCR扩增：以表1中的序列为引物，以B.thuringiensi基因组DNA为模版，PCR扩增aiiA基因序列并纯化；表1引物划线部分为NdeI和XbaI限制性酶切位点；(2)克隆：将步骤(1)获得的aiiA基因序列克隆到pCzn1载体上得到重组质粒pCzn1-aiiA；(3)转化：将步骤(2)获得的重组表达质粒pCzn1-aiiA转化到E.coliArcticExpressTM(DE3)中得到本专利技术的工程菌。根据本专利技术的高产酰基高丝氨酸内酯酶的工程菌，其中步骤(1)中所述的B.thuringiensi基因组DNA是将B.thuringiensi接种至50mLLB培养基中，200rpm震荡培养至稳定期后，提取B.thuringiensi的基因组DNA得到。根据本专利技术的高产酰基高丝氨酸内酯酶的工程菌，其中步骤(2)中所述的重组质粒pCzn1-aiiA转化入E.coliTOP10克隆菌株阳性筛选，所得的阳性克隆子测序，并以限制性内切酶NdeI和XbaI验证。本专利技术的第二方面是提供本专利技术制备的工程菌在抑制循环冷却水系统中微生物污染的用途，尤其是在抑制循环冷却水系统中浮游微生物污染的用途。循环冷却水系统中包含着两种不同的微生物种群：存在于循环冷却水整体流动中的浮游微生物和在生物粘泥中的附着微生物，一般以循环水系统中浮游微生物数量为监测目标评价水质的好坏。本专利技术人发现，现有的群体淬灭菌，如B.thuringiensi等，对循环冷却水系统中的浮游微生物抑制效果不明显，一般不超过20％，而本专利技术的工程菌，对循环冷却水系统中的浮游微生物抑制率可高达73％，可应用于工业循环冷却水微生物、尤其是浮游微生物污染的抑制。附图说明图1是本专利技术实施例1步骤(1)PCR扩增得到的aiiA序列的琼脂糖凝胶电泳图，其中，M为DL2000DNAMarker；1为aiiA目的基因；图2是本专利技术实施例1步骤(2)制备的重组质粒pCzn1-aiiA的结构示意图。具体实施方式本专利技术使用的实验材料和药品均可商购获得。实施例1工程菌的构建1.1试剂和耗材ProteinMarker，购自Thermo公司；IPTG、Acr、Bis、Tris，购自Sigma公司；福氏佐剂，购自Sigma公司；SDS/十二烷基硫酸钠、酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，购自Solarbio公司；TEMED，购自BIO-RAD公司；X-Gal，购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；Tyrptone、YeastExtract，购自OXOID公司；PCR反应管，购自Fisher公司；0.22μm无菌滤器和透析袋，购自Millipore公司；Ni2+-IDA亲和层析胶，购自Novagen公司；Agarose，购自上海基因公司；GoodView核酸染料购自北京赛百盛基因技术有限公司；DNA胶纯化试剂盒，购自AXYGEN公司；PCR产物纯化试剂盒，购自novoprotein公司；其它试剂均为国产分析纯。1.2仪器Allegra21R台式高速冷冻离心机，购自美国BECKMAN公司；台式高速离心机，购自德国SORVAL公司；BiologicLP层析系统、MiniProteanII垂直平板电泳系统、GelDoc2000成像系统、水平电泳系统，购自美国BIO-RAD公司；PTC-200基因扩增仪，购自美国MJResearch公司；320-SpH计，购自美国MettlerToledo公司；AR5120电子天平，购自美国AHOMS公司；MultiTempIII恒温水浴锅、HoferΜV-25紫外透射仪，购自美国AmershamPharmacia公司；雪花状制冰机，购自日本SANYO公司；JY92-2D超声波细胞粉碎机，购自中国新芝科器研究所；超净工作台，购自中国苏净集团；NANODROP2000，购自Thermo公司。1.3菌株和载体B.thuringiensi由本实验室分离保存，可以对外公开发放；pCzn1质粒，由南京钟鼎生物公司保存；E.coliTOP10克隆菌株，由南京钟鼎生物技术有限公司保存；E.coliArcticExpressTM(DE3)表达菌株，购自购自安捷伦公司，由南京钟鼎生物技术有限公司保种。1.4溶液及其配制LB培养基：蛋白胨10g，酵母浸出粉5g，NaCl10g，用蒸馏水定容至1L，调节pH为7.0，121℃灭菌20min，固体培养基以1.5％比例加入琼脂。DNA提取溶液由以下几部分组成：①TE缓冲液(pH＝8.0)：量取10mMTris-HClBuf本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高表达酰基高丝氨酸内酯酶的工程菌，以E.coli Arctic Express

【技术特征摘要】
1.一种高表达酰基高丝氨酸内酯酶的工程菌，以E.coliArcticExpressTM(DE3)为表达载体，整合有aiiA目的基因。2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于：所述的aiiA目的基因序列的序列号为DQ440581.1。3.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于：所述的工程菌通过以下方法构建：(1)PCR扩增：以表1中的序列为引物，以Bacillusthuringiensis基因组DNA为模版，PCR扩增aiiA基因序列并纯化；(2)克隆：将步骤(1)获得的aiiA基因序列克隆到pCzn1载体上得到重组质粒pCzn1-aiiA；(3)...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶姜瑜，宋丽，李大荣，窦建军，杨建峡，王艺超，
申请(专利权)人：重庆融极环保工程有限公司，重庆大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50