采用去毒重组大肠杆菌(E.coli)不耐热肠毒素突变体LTS61K作为载体蛋白来偶联多糖。所述LTS61K含有在氨基酸位置61处包括赖氨酸的突变成熟亚单元A(LTA)和野生型成熟亚单元B(LTB)。通过还原胺化反应将各种类型的细菌荚膜多糖抗原与所述LTS61K蛋白化学偶联。所述偶联多糖-LTS61K产物已以物理、化学和生物化学方式识别为可溶形式。以肌内方式对兔进行免疫以通过检测抗多糖抗原IgG效价的ELISA和血清杀菌分析测定偶联疫苗的免疫原性，由此测定抗体的功能活性。研究结果显示，偶联多糖-LTS61K疫苗相比于单独的多糖或与LTS61K混合的多糖在血清中诱导更高的多糖特异性IgG效价和更大的杀菌活性。抗LTS61K血清IgG抗体的存在减轻由大肠杆菌(ETEC肠毒性大肠杆菌)引起的旅行性腹泻。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
多糖疫苗在不使用载体蛋白制备时缺少免疫记忆反应。当前已知的偶联疫苗包括细菌荚膜多糖，例如流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)b型、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis) C 组和肺炎链球菌(Streptococcus pnemoniae)血清型 1、3、4、5、6B、7F、9V、14、19F、23F。所述疫苗共价偶联到载体蛋白，例如破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM197、突变体无毒白喉毒素或脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白。这些多糖偶联疫苗尤其在年龄小于两岁的婴儿中可诱导T细胞依赖反应；且其可促发长期免疫记忆，产生高亲和カ抗体，且可降低鼻咽移生和传播速率。然而，当前销售的大部分细菌多糖偶联疫苗应用破伤风类毒素(TT)或白喉类毒素(DT)作为载体蛋白。TT和DT，这两种类毒素蛋白是用于婴儿/儿童的合法疫苗；在短期内高频率接种TT和DT可能会影响免疫原性和安全性。(降低的对同时投予婴儿的具有共同蛋白表位的复合疫苗的反应(Reduced response to multiple vaccines sharingcommonprotein epitopes that are administered simultaneously to infants).感染与免疫(Infect. Immun.) 1998 ；66(5) :2093-8 ;组合肺炎球菌-脑膜炎球菌疫苗在婴儿中的免疫原性和安全性随机控制试验(Immunogenicity and safety of a combinationpneumococcal-meningococcal vaccine in infants a randomized controlled trial).美国医学协会杂志(JAMA) 2005 ;293 (14) :1751-8)。因此，本专利技术提供用于偶联疫苗的新型载体蛋白 LTS61K。
技术实现思路
本专利技术包括多糖与去毒大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)的偶联，其可用作疫苗来针对诸如流感嗜血菌和肺炎链球菌等传染性细菌的效应进行保护或免疫且减轻由肠毒性大肠杆菌引起的旅行性腹泻。本专利技术的ー个方面涉及以纯化形式分离的共价偶联的多糖-LTS61K疫苗。这些偶联产物在哺乳动物中具有非常优秀的免疫原性和杀细菌性特性。另ー方面涉及将有效量的偶联多糖-LTS61K疫苗投予需要抵抗流感嗜血菌b型(Hib)的哺乳动物的方法。本专利技术疫苗刺激T辅助细胞反应，在再次暴露后展现强加强反应且具有高抗体效价。本专利技术的另一方面涉及通过还原胺化和分离经纯化偶联产物产生偶联多糖-LTS61K的方法。根据本专利技术，已发现偶联多糖与LTS6IK来制备本专利技术疫苗的优选方法是高碘酸盐氧化天然PS，之后进行还原胺化。本专利技术偶联物中采用的LTS61K阐述于以下文献中在2007年8月13日申请的第PCT/US2007/075801号PCT申请案；在2007年7月18日申请的第US 11/779419号美国申请案、在2008年5月15日申请的US 12/120，953和在2010年3月23日申请的US12/729, 649 ；以及在2006年10月27日申请且在2009年I月获准的第95139707号台湾专利申请案。这些申请案中的每一者中阐述的标的物都是以引用方式并入本文中。附图说明图I概括性绘示LT载体蛋白。 图2是Hib PRP糖的结构图。图3展示若干种偶联方法。图4展示本专利技术的还原胺化方法。图5绘示PRP与LTS61K通过还原胺化偶联。图6展示在NaIO4处理后经氧化PRP的HPLC-SEC-RI洗脱曲线。图7是经氧化PRP的NMR谱。此光谱确认在高碘酸盐氧化后在PRP上形成醛基团。图8展示远UV⑶谱，其确认在LTS61K与PRP-LTS61K偶联样品的二级结构之间无差异；且还展示荧光谱，其确认在LTS61K与PRP-LTS61K偶联样品的λ最大三级结构之间无差异。图9展示氨基酸分析，其确认PRP与LTS61K成功偶联且形成共价键。图10展示SDS-PAGE蛋白质印迹(Western Blotting)分析以确认PRP与LTS61K之间的共价偶联。图11展示通过IEF PAGE分析的经纯化PRP-LTS61K偶联物。图12展示IEF蛋白质印迹以确认PRP与LTS61K之间的共价偶联。图13通过HPLC-SEC-UV-MALLS-RI确认经纯化偶联疫苗的纯度。图14展示通过IEF PAGE分析经纯化PRP-LTS61K偶联物以确认经纯化偶联疫苗的纯度。图15概述对本专利技术Hib PRP-LTS61K偶联物的大鼠免疫原性研究。图16概述对本专利技术Hib PRP-LTS61K偶联物的兔免疫原性研究。图17图解说明对本专利技术Hib PRP-LTS61K偶联物的兔免疫原性研究的结果，即兔血清杀菌效价分析和抗PRP IgG Ab效价的结果。图18图解说明关于兔免疫原性研究的其它信息。图19图解说明对本专利技术Hib PRP-LTS61K偶联物的兔免疫原性研究的结果，即兔血清杀菌效价(BA)和抗PRP IgG Ab效价(OD)的结果。图20展示抗PRP和抗LTS61K抗体反应研究的其它兔免疫原性ELISA的结果。图21展示其它兔血清杀菌分析和抗PRP IgG Ab的结果。图22展示在第四次免疫后其它兔血清杀菌分析和抗PRP IgG Ab的结果。图23展示在小鼠中对肺炎球菌PS血清型14-LTS61K偶联物的免疫原性。具体实施方式现在已经发现，根据本专利技术制备的偶联多糖-LTS61K疫苗可令人惊讶地相比于多糖或与LTS61K混合的多糖在血清中诱导更高的多糖特异性IgG抗体效价和更大的杀菌活性。本文采用的缩写列表如下CFU :菌落形成单位ELISA :酶联免疫吸附分析Hib :流感嗜血菌b型IEF:等电聚焦LT :不耐热肠毒素 MALLS :多角度激光散射OD :光密度PNPS :肺炎球菌多糖PRP :多核糖基核糖醇磷酸盐PS :多糖SDS-PAGE :十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳SEC_HPLC :尺寸排除高压液相色谱RI :反射率本专利技术偶联物中采用的新载体蛋白是去毒重组大肠杆菌不耐热肠毒素突变体LT，更具体来说是LTS61K。在LT突变体中，A和B亚单元形成典型的AB5全毒素结构。去毒LT突变体(LTS61K)含有在氨基酸位置61处包括K的突变成熟亚单元A (LTA)和野生型成熟亚单元B(LTB)。LTS61K使产物的毒性显著低于野生型LT。载体蛋白绘示于图式中的图I中。选作本专利技术起始材料之一的LTS61K的专利技术是基于以下意外发现含有突变LTa的LT展现与其野生型对应物相比降低的毒性且同时保留免疫原性。此突变LTa在对应于野生型LTa的位置61的位置处具有氨基酸取代，所述野生型LTa的氨基酸序列SEQ IDNO 5展示于以引用方式并入本文中的所引用专利申请案中。因此，LTS61K的特征在于包括突变LTa的经分离多肽，所述突变LTa在对应于SEQ ID NO 5的位置61的位置处含有并非S、T和F的氨基酸残基。取代氨基酸残基可为03、!1、1、1(、1^、队？、0、1 、￥或1。其可能是天然存在的氨基酸或非天然存在的氨基酸，例如D-氨基酸或β-本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐悠深，郭怡玲，洪国展，吕元馨，阮大同，
申请(专利权)人：DCB美国有限责任公司，
类型：
国别省市：
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