一种猪大肠杆菌病灭活疫苗的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种猪大肠杆菌病灭活疫苗的制备方法，具体方法为分离得到血清型为O60，O101和O138致病性的猪大肠杆菌菌株，进行种子培养和扩大培养后，制备获得各菌株菌液，对菌液进行活菌计数，各菌株细菌悬液活菌的含量不低于100亿CFU/mL，符合要求的进行菌液灭活，经灭活的大肠杆菌混合菌液，按照每毫升混合菌液含蜂胶9-10mg的比例加入蜂胶提取液，加注过程中要边加边摇荡，制成浊状菌苗。结果表明，疫苗使用后，因大肠杆菌引起的仔猪黄白痢的发病率为7.69％，死亡率1.92％；未免疫仔猪的黄白痢发病率为32.65％，死亡率14.29％，说明疫苗免疫效果较好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于兽用生物制品
，涉及一种猪疫苗的制备方法，具体为一种猪 大肠杆菌病灭活疫苗的制备方法。
技术介绍
大肠杆菌病（colibacillosis)是由病原性大肠埃希氏菌所致的一种急性、多型 性、肠道传染病，能严重影响仔猪的成活率。其临床表现主要为仔猪黄痢、仔猪白痢和水肿 病。其中黄痢多发于7日龄以内哺乳仔猪（病猪主要表现为排黄色或黄白色水样粪便）； 白痢多发于10-30日龄仔猪（病猪粪便呈乳白或灰白色）：而水肿病多发于断奶前后的仔 猪（病猪多表现神经症状，以胃壁、肠系膜等组织水肿为特征）。这三种病对养猪生产危害 极大，在养猪业危害中居首位，严重威胁着养猪业的健康发展，导致饲料报酬率降低、仔猪 成活率下降、生长缓慢、生长发育停滞（即所谓的僵猪），甚至死亡。由于本病发生的原因很 多，常表现为多种因素相互作用的结果，有时呈交叉感染，导致临床防治困难，引起仔猪大 量死亡，给养猪业带来巨大的经济损失。因此，如何采取有效的措施预防和控制猪场大肠杆 菌病已成为养猪业生产的一项重要课题。 目前，猪大肠杆菌病在世界各地均有发生，在我国该病也相当普遍，由于各场的 饲养管理、卫生条件、防疫程序等不同，所以大肠杆菌的发病率也有所不同。有资料显示 我国华东地区部分规模化猪场，仔猪黄白痢平均发病率为29. 0% ±3. 096,平均死亡率为 20. 4% ±1. 9% ;猪水肿病平均发病率为17. 7% ±3. 5%，平均死亡率为11. 0% ±1. 3%。 猪大肠杆菌病危害严重，细菌的多重耐药现象已十分严重，四耐及以上的菌株占 总受试菌的96%，76. 5%菌株耐6~10种药物。药物预防与治疗变得越来越困难。所以， 研制猪大肠杆菌疫苗逐渐得到人们的认可和重视。由于大肠杆菌血清型非常复杂，而市场 上销售的猪大肠杆菌疫苗与各地致病性猪大肠杆菌血清型有差异，免疫效果不理想。
技术实现思路
本专利技术旨在提供，目的在于解决由于大肠 杆菌血清型非常复杂，而市场上销售的猪大肠杆菌疫苗与各地致病性猪大肠杆菌血清型有 差异，免疫效果不理想的技术问题。 本专利技术通过以技术方案实现： ，其特征在于包括如下步骤： 1)菌种选择； 2)培养基的配置； 3)菌液制备； 4)活菌计数； 5)菌株灭活； 6)疫苗制备； 进一步的，所述的步骤具体为： 步骤⑴具体为从集的疑似猪大肠杆菌病的病料中分离出血清型为06(|，O ltll和 〇1383种致病性的猪大肠杆菌菌株，作为制苗菌株。 步骤（2)具体为制备培养基，营养琼脂培养基成分：蛋白胨11. 0g，牛肉膏3. 0g，氯 化钠5. 0g，琼脂15. 0g，水1000ml，PH值7. 3±0. 1 ;麦康凯琼脂培养基成分：蛋白胨21g，牛 胆盐5g，氯化钠5g，琼脂14g，乳糖10g，中性红0. 03g，水1000ml，PH7. 4 ;马丁肉汤培养基成 分：葡萄糖 5g，蛋白胨 2. 5g，KH2P04 ? 3H20 0? 5g，MgS04 ? 7H20 0? 25g，0. 1%孟加拉红溶液 I. 65ml，琼脂7. 5~10g，蒸馏水500ml，自然pH，2%去氧胆酸钠溶液IOml (预先灭菌，临用 前加入），链霉素溶液（lOOOOu/ml) I. 65ml (临用前加入）。 步骤（3)具体为将各分离的菌株分别接种于马丁肉汤，37°C培养ld，然后划线接 种到麦康凯琼脂平板上培养，从中选择表面光滑、隆起、呈粉红色的典型菌落10个，再次接 种于马丁肉汤，37°C培养ld，进行纯粹检验后，作为种子，将种子液接种到营养琼脂，37°C培 养18h，置室温下，用灭菌生理水浸泡5~Smin，然后刮下菌苔，再使用灭菌纱布过滤到灭菌 瓶中，得到各菌株的细菌悬液。 步骤（4)具体为分别取各菌株的细菌悬液I mL，做10倍递增稀释，然后按照常规 方法进行活菌计数，各菌株细菌悬液活菌的含量不低于100亿CFU/mL。 步骤（5)具体为根据活菌计数的结果，将菌株06(|、01(11、O 138按4:3:2的比例混合， 加人浓度为〇. 3%的甲醛，于37°C灭活ld，在此期间每隔4h要摇荡1次。 步骤（6)具体为经灭活的大肠杆菌混合菌液，检验合格后，按照每毫升混合菌液 含蜂胶9-10mg的比例加入蜂胶提取液，加注过程中要边加边摇荡，制成浊状菌苗，该菌苗 含菌量为100亿CFU/mL，蜂胶干物质的量为10mg/mL。 本专利技术所述的蜂胶在冰箱内4°C以下保存，使用前粉碎，过筛需要在4°C~8°C温 度下进行，按照质量体积比1:4比例加入95 %乙醇，室温浸泡l-2d，冷却，离心取上清液，即 得棕红色纯净蜂胶。去除干渣，浸液放置于4°C以下冰箱保存备用。 本专利技术的有益效果为： 1)用蜂胶为佐剂，蜂胶制剂注射方便，吸收较快，注射部位无病理变化，不影响胴 体品质； 2)采用优势血清型的致病性大肠杆菌菌株06(|、01(11、O 138混合作为制苗种子，研制 猪大肠杆菌多价蜂胶灭活疫苗； 结果表明，疫苗使用后，因大肠杆菌引起的仔猪黄白痢的发病率为7. 69%，死亡率 1.92% ;未免疫仔猪的黄白痢发病率为32. 65%，死亡率14. 29%。经统计分析，差异极显 著，说明疫苗免疫效果较好。【具体实施方式】 下面结合实施例对本专利技术做进一步的说明，以下所述，仅是对本专利技术的较佳实施 例而已，并非对本专利技术做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示 的
技术实现思路
加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本专利技术方案内容，依据本专利技术 的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本专利技术的保护范围内。 应用实施例一 实施例1 -种猪大肠杆菌病灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤： a.从安阳地区米集的疑似猪大肠杆菌病的病料中分呙出血清型为06(|，0 1(11和O 1383 种致病性的猪大肠杆菌菌株，作为制苗菌株； b.将所得菌株进行培养，所使用的种子培养基为麦康凯琼脂，扩大培养基用普通 琼脂培养基； c.分别将血清型为06(|，Oltll和O 1383种致病性的猪大肠杆菌菌株接种于马丁肉汤， 37°C培养ld，然后划线接种到麦康凯琼脂平板上培养当前第1页1 2 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪大肠杆菌病灭活疫苗的制备方法，其特征在于包括如下步骤：1)菌种选择；2)培养基的配置；3)菌液制备；4)活菌计数；5)菌株灭活；6)疫苗制备。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：宋玉伟，王国栋，梁秀丽，冯东亚，李春堂，
申请(专利权)人：安阳工学院，
类型：发明
国别省市：河南;41