一种副猪嗜血杆菌感染仔猪模型的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种副猪嗜血杆菌感染仔猪模型的构建方法，涉及动物模型构建领域，包括将若干CD仔猪养殖至18～25日龄，均分为感染组A和对照组B，判定CD仔猪体内不存在HPS病原、不含APP病原或APP抗体后，饲养至40～70日龄时，向感染组A中所有CD仔猪气管内接种HPS菌种；向对照组B中所有CD仔猪气管内注射培养基，得到空白组B′，观察并检测攻毒组A′、空白组B′，提取攻毒组A′、空白组B′的肺脏组织的总DNA，判定攻毒组A′的肺脏组织中存在HPS病原的同时，空白组B′的肺脏组织的中不存在HPS病原。本发明专利技术能够降低实验成本、简便建模流程，结果的准确度较高，更加符合动物福利的相关要求。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了，涉及动物模型构建领域，包括将若干CD仔猪养殖至18～25日龄，均分为感染组A和对照组B，判定CD仔猪体内不存在HPS病原、不含APP病原或APP抗体后，饲养至40～70日龄时，向感染组A中所有CD仔猪气管内接种HPS菌种；向对照组B中所有CD仔猪气管内注射培养基，得到空白组B′，观察并检测攻毒组A′、空白组B′，提取攻毒组A′、空白组B′的肺脏组织的总DNA，判定攻毒组A′的肺脏组织中存在HPS病原的同时，空白组B′的肺脏组织的中不存在HPS病原。本专利技术能够降低实验成本、简便建模流程，结果的准确度较高，更加符合动物福利的相关要求。【专利说明】
本专利技术涉及动物模型构建领域，具体涉及一种副猪嗜血杆菌感染仔猪模型的构建 方法。
技术介绍
HPS (Haemophilus parasuis，副猪嗜血杆菌）是一种定居在猪上呼吸道部位的革 兰氏阴性短小杆菌，HPS的毒力菌株侵入猪体后会使猪产生严重的系统性炎症疾病，临床表 现以格拉泽氏病（Glaser'S Disease)，即血纤维蛋白性心包炎、多发性关节炎和脑膜炎； 有些感染猪只还表现出急性肺炎和急性败血症。 从上个世纪末至今，HPS感染给世界各国的养猪业造成了严重的损失，HPS已成为 猪场最主要的细菌性病原体之一，在我国呈全国性病发趋势。 现阶段没有预防HPS感染的有效措施。通常，在猪感染HPS后大量使用抗生素进 行治疗，但一方面抗生素使用会造成养殖成本上升；另一方面大量抗生素的使用会导致排 泄物和肉制品中存有抗生素残留，排泄物排入环境中容易造成环境污染，人体摄入含有抗 生素的肉制品后，抗生素会在人体内聚集，导致人体抵抗力降低。因此，需要降低猪感染HPS 后抗生素的使用量。 目前降低抗生素使用量的途径包括使用疫苗和培育抗病猪种，由于抗病育种可以 从根本上解决病原体感染，因此，抗病育种成为未来猪育种产业发展的新方向。研宄显示： 常规的猪群中，不同的猪个体感染HPS后的表现存在差异，该差异与猪个体的遗传基因有 关，该现象为通过遗传改良培育出抗性品系和/或抗性品种提供了充分的依据。 目前，本领域技术人员通过建立感染模型来筛选相关抗病基因，建立可靠的活体 感染模型是培育出抗性品系和/或抗性品种的关键。建立感染模型（以下简称建模）具体 是指：通过实施攻毒试验，收集攻毒后（含对照）的猪只在临床病征、生长发育、体温变化、 血液参数和免疫指标表型数据用以评判建模效果，最终在实验室（或实验动物中心等实验 性场地）复制出病原体感染猪只的相关生物学现象。 根据实验猪只的区别，可以将现有的感染模型分为普通级、⑶级 (Colostrum-Deprived,禁食母猪初乳）、CDCD 级（Caesarean-Derived and Colostrum-Deprived，剖腹产、禁食母猪初乳）和 SPF 级（Specific pathogen free，无特定 病原体）。 普通级感染模型建立时，直接通过母体初乳对仔猪进行喂食，并对仔猪进行多次 疫苗免疫，由于母体初乳中含有大量的抗体，可能会导致仔猪机体产生免疫，同时，进行疫 苗免疫后也会产生抗体，产生抗体后的仔猪经HPS攻毒后可能会自行康复，难以复制HPS感 染；HPS是一种寄居在猪上呼吸道部位的常见菌和机会性致病菌，母猪通常携带有HPS，因 此会直接感染猪仔，影响建模效果。总之，普通级感染模型建立过程中存在较多影响因素， 尤其是模型不稳定、结果不准确。 CDCD级感染模型建立时，仔猪是通过剖腹产得到的，对母猪实施剖腹产时，需要配 备专业能力较强的外科手术医生和严格的无菌手术室，成本较高，难以推广。 SPF级感染模型建立时，需要使用HPS阴性猪，现在，HPS阴性猪群已很难找到，建 模成本较高，操作难度较大，可靠性较低，难以推广。 CD级感染模型建立时，仔猪经母猪自然分娩后立即与猪舍隔离，一方面隔绝了 CD 仔猪出生早期HPS在上呼吸道的定植，另一方面由于禁食初乳最大程度上避免了母体抗体 的不利影响；建模期间不需要苛刻的无菌环境，饲养条件也相对宽松，操作较为简单。所以 CD仔猪是最适合作为HPS活体感染建模的实验动物，综合比较来看有望使得格拉泽氏病的 复制更稳定、更现实、更可靠。 目前，Blanco等人所在的课题组（西班牙CISA)以及与之合作的PIC种猪公司和 美国Minnesota大学相关课题组利用CD仔猪进行HPS感染建模。 现有的⑶级感染模型建立时存在以下缺陷： (I)CD仔猪喂养时，先使用牛初乳喂食3天，通常来讲，牛初乳的获得并不方便且 需要做灭菌处理，不仅提高了实验成本而且可能会因含有牛肠炎病毒增加 CD仔猪腹泻风 险，CD仔猪的死亡率较高。 (2)已有模型对21日龄的⑶仔猪进行攻毒，由于21日龄的⑶仔猪体内器官发育 尚不完善，相关实验结果可能难以全面反映猪只感染HPS后的症状，准确度较低；同时，使 用与生产上断奶日龄（15?21日龄）相接近的CD仔猪进行实验，不太符合动物福利的相 关举措。 (3)现有的⑶仔猪至感染前存活率仅为50%?78. 9%，存活率较低，实验成本较 尚。
技术实现思路
针对现有技术中存在的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种副猪嗜血杆菌感染仔猪 模型的构建方法，能够降低实验成本、简便建模流程，结果的准确度较高，更加符合动物福 利的相关要求。 为达到以上目的，本专利技术采取的技术方案是：一种副猪嗜血杆菌感染仔猪模型的 构建方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤一、将自然分娩得到的若干禁食母猪初乳CD仔猪进行隔离，饲养至18?25 日龄，将未死亡的⑶仔猪随机均分为两组：感染组A和对照组B ;待感染组A和对照组B的 所有⑶仔猪生长至30?40日龄时，采集感染组A和对照组B中所有⑶仔猪的鼻拭子和 非抗凝外周血；判定鼻拭子中不存在副猪嗜血杆菌HPS病原、且非抗凝外周血中不含猪胸 膜肺炎放线杆菌APP病原或APP血清抗体，转入步骤二； 步骤二、待感染组A和对照组B的所有⑶仔猪生长至40?70日龄时，向感染组 A中所有CD仔猪的气管内接种剂量为107CFU?109CFU、分散于培养基中的HPS细菌，得到 攻毒组Y ;接种HPS细菌的同时，向对照组B中所有CD仔猪气管内注射与HPS剂量相同 的培养基，得到空白组V，转入步骤三； 步骤三、接种HPS细菌1?20天后，分别提取攻毒组A'、空白组B'的肺脏组织 的总DNA，当攻毒组Y的肺脏组织的总DNA中存在HPS病原、且空白组^的肺脏组织的 总DNA中不存在HPS病原时，建模成功；当攻毒组Y的肺脏组织的总DNA中不存在HPS病 原，或空白组B'的肺脏组织的总DNA中存在HPS病原时，重新执行步骤一?步骤三。 在上述技术方案的基础上，步骤一中所述将自然分娩得到的若干CD仔猪进行隔 离，养殖至18?25日龄包括以下步骤：母猪自然分娩时人工助产，防止仔猪分娩后接触母 猪、地面、栏舍及其他猪场物品，立即放入温度为33?35°C的无菌保温箱中，待CD仔猪体表 干燥、保温箱内站立稳定或行走自如后，使用奶瓶饲喂温度为37°C的温开水约40ml，出生 后本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种副猪嗜血杆菌感染仔猪模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、将自然分娩得到的若干禁食母猪初乳CD仔猪进行隔离，饲养至18～25日龄，将未死亡的CD仔猪随机均分为两组：感染组A和对照组B；待感染组A和对照组B的所有CD仔猪生长至30～40日龄时，采集感染组A和对照组B中所有CD仔猪的鼻拭子和非抗凝外周血；判定鼻拭子中不存在副猪嗜血杆菌HPS病原、且非抗凝外周血中不含猪胸膜肺炎放线杆菌APP病原或APP血清抗体，转入步骤二；步骤二、待感染组A和对照组B的所有CD仔猪生长至40～70日龄时，向感染组A中所有CD仔猪的气管内接种剂量为107CFU～109CFU、分散于培养基中的HPS细菌，得到攻毒组A′；接种HPS细菌的同时，向对照组B中所有CD仔猪气管内注射与HPS剂量相同的培养基，得到空白组B′，转入步骤三；步骤三、接种HPS细菌1～20天后，分别提取攻毒组A′、空白组B′的肺脏组织的总DNA，当攻毒组A′的肺脏组织的总DNA中存在HPS病原、且空白组B′的肺脏组织的总DNA中不存在HPS病原时，建模成功；当攻毒组A′的肺脏组织的总DNA中不存在HPS病原，或空白组B′的肺脏组织的总DNA中存在HPS病原时，重新执行步骤一～步骤三。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈洪波，程蕾，赵书红，张晶，向敏，侯永清，高其双，郭玲，邱银生，黎旺明，
申请(专利权)人：武汉轻工大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42