一种用于农作物病害防治的重组菌株制造技术

本发明专利技术提供种用于农作物病害防治的重组菌株，与改造的群体感应淬灭蛋白MomL制备成生物制剂，对一系列植物病害细菌进行防治。本发明专利技术首先提供一种重组产酶溶杆菌，该重组产酶溶杆菌携带有用于重组表达群体感应淬灭酶MomL基因的重组载体，该重组载体的启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO:1；所述的改造后的群体感应淬灭酶MomL41，其氨基酸序列为SEQ ID NO:4。本发明专利技术利用构建的重组表达群体感应淬灭蛋白MomL的产酶溶杆菌，以及改造后的群体感应淬灭蛋白MomL41制备植物病害防治制品，提高了对植物细菌性软腐病致病菌的抑制效果，并应用于植物细菌性软腐病防治。

Recombinant strain for preventing and curing crop diseases

The invention provides a recombinant strain for preventing and curing crop diseases, and a modified quorum induced quenching protein MomL is used to prepare biological agents, and a series of plant disease bacteria are controlled. The invention firstly provides a recombinant Lysobacter enzymogenes, the recombinant Lysobacter enzymogenes carrying recombinant expression recombinant vector for quorum quenching enzymes of MomL gene, the nucleotide sequence of the recombinant vector promoter for SEQ ID NO:1 quorumsensing; the transformation of quenching after inactivation of MomL41, the the amino acid sequence of SEQ ID NO:4. The invention uses the expression of enzyme producing quorum quenching protein MomL recombinant strain, and quorum sensing quenching after the transformation of the inactivated protein MomL41 preparation plant disease prevention products, improve the inhibitory effect on plant bacterial soft rot pathogens, and applied to the disease prevention and control of plant bacterial soft rot.

【技术实现步骤摘要】
一种用于农作物病害防治的重组菌株
本专利技术属于植物病害防治
，具体涉及一种用于农作物病害防治的重组菌株。背景介绍植物病原菌存在于各种经济作物的不同生长阶段，其致病性严重影响作物生长及经济效益。目前应对该问题，主要是通过使用抗生素的手段提高农作物的抗病害能力。但是抗生素的使用诱使抗药性细菌出现(Defoirdtetal.2011)。并且药物会在植物体内残留并导致环境污染。新型环境友好型的病害防治策略需要深入研究及广泛应用。MomL是属于金属-β-内酰胺酶家族的群体感应淬灭酶。MomL具有明显的抑制病原菌致病因子及防病害能力，可作为生防蛋白进行改造利用。但是在正常培养条件下，群体感应淬灭酶的转录表达水平并不高，这影响到有益菌株作为生防菌的广泛应用，因此将群体感应淬灭酶在有益菌中异源表达，提高有益菌的群体感应淬灭酶的表达水平变得非常重要。产酶溶杆菌广泛生存于土壤和水环境中，能够分泌一系列胞外酶及具有抗植物真菌病原菌活性的次级代谢产物，是溶杆菌属中最具有生物防治潜力的一种革兰氏阴性菌。近年来，产酶溶杆菌作为一种新的生物防治剂被普遍用于防治由真菌引起的农作物病害(Borasretal.1993；Folmanetal.2003)；相对而言，对植物细菌性病害的控制报道较少，并且没有群体感应淬灭活性。为扩大产酶溶杆菌对植物致病菌的防治范围，可以将抑菌蛋白MomL在其内异源表达构建具有更广谱抑菌活性的产酶溶杆菌工程菌株用于植物细菌性病害的防治。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供种用于农作物病害防治的重组菌株，与改造的群体感应淬灭蛋白MomL制备成生物制剂，对一系列植物病害细菌进行防治。本专利技术首先提供一种重组产酶溶杆菌，该重组产酶溶杆菌携带有用于重组表达群体感应淬灭酶MomL基因的重组载体，该重组载体的启动子的核苷酸序列为SEQIDNO:1；所述的群体感应淬灭酶MomL，其氨基酸序列为SEQIDNO:2；编码群体感应淬灭酶MomL的基因，其核苷酸序列为SEQIDNO:3；上述的重组产酶产酶溶杆菌用于植物病害防治和制备植物病害防治的生物制品；本专利技术再一个方面提供一种植物病害防治的生物制品，包含有上述的重组产酶溶杆菌和改造后的群体感应淬灭酶MomL；所述的改造后的群体感应淬灭酶MomL41，其氨基酸序列为SEQIDNO:4；编码改造后的群体感应淬灭酶MomL41的基因，其核苷酸序列为SEQIDNO:5。本专利技术利用构建的重组表达群体感应淬灭蛋白MomL的产酶溶杆菌，以及改造后的群体感应淬灭蛋白MomL41制备植物病害防治制品，提高了对植物细菌性软腐病致病菌的抑制效果，并应用于植物细菌性软腐病防治。附图说明图1：MomL41对Pcc致病因子果胶酶的抑制作用，图2：重组表达菌株与Pcc共培养对Pcc果胶酶表达的抑制作用，图3：MomL41对果胶酶产生相关基因的转录影响分析，图4：酮还原酶基因片段和PgroEL的双酶切凝胶电泳检测结果图，图5：LeMomL菌株与野生菌株菌落颜色对比图，图6：LeMomL菌株对C6-SHL的降解作用图，图7：LeMomL菌株对Pcc存活率率的影响图，图8：LeMomL菌株对由Pcc引起的大白菜软腐病的抑制效果图。具体实施方式MomL蛋白的稳定性有待提高，在室温下放置一段时间后酶活降低较快，从而影响这类蛋白后续开发及广泛应用。因此，申请人对MomL蛋白进行了改造。改造后的MomL蛋白具有更好的稳定性。下面结合实例对本专利技术的方法做进一步说明。但实例仅限于说明，并不限于此)实施例1：在产酶溶杆菌中异源表达群体感应淬灭酶MomL的方法研究表明外源群体感应淬灭酶基因momL在陆生菌产酶溶杆菌中存在表达效率低下的问题。为了解决这一问题，申请人对陆生菌产酶溶杆菌OH11基因组和momL基因的序列组进行了分析，最终发现核苷酸序列为SEQIDNO:1的PgroEL启动子使momL基因在产酶溶杆菌中具有很高的表达能力及稳定性。通过产酶溶杆菌OH11的全基因组测序及基因注释结果可知，其基因组中基因groEL与groES反向共转录，因此推测基因groEL的启动子位于基因groES编码区的上游，通过Softberry及BerkeleyDrosophilaGenomeProject(BDGP)对启动子进行在线预测并得到相关序列，其中启动子的SEDIDNO为KY863517，启动子序列如下：CGATGCCTTTGTGCCAGATCGCCAGACCGGACCGAAAGGCGTCGGGCCTGAAAGCCCTCCCACTAGAGCCCCCAGGGTGAAGAGCCCTCCCACAACAGCTCCGGGGTCCGCGGGCTCTCCCAGCGCCGCCGGCCGGCCCCGCGGACCGACCGCTGTCACCGTTCCGATGCAGGATTCGTCGCGGCCCCCCTTGAAAGCCGTCCGAGGCGCCCTATCTCCGAACCAGTCCCGGCTTGCCGGGCGCTTTCGTCCCCGGCATTGGCACTCGCCGGGTGCGACTGCTAAAATTCCCGTTCTTTATCCACCAATTCAATTACTTACAGAGGTCGCC(SEQIDNO:1)。产酶溶杆菌作为一种新的生物防治剂被普遍用于防治由真菌引起的农作物病害；但并没有群体感应淬灭的抑菌活性。此工程菌株扩大了产酶溶杆菌对植物致病菌的防治范围，使其具有更广谱抑菌活性，使该工程菌株用于多种植物细菌性病害的防治。实施例2：产酶溶杆菌过表达载体pEX18-W的构建。选用产酶溶杆菌中黄色素合成基因簇中的关键基因酮还原酶合成基因作为重组载体的整合位点，利用软件PrimerPremier5设计基因片段的上、下引物分别带有EcoRⅠ、KpnⅠ限制性酶酶切位点，up：5’-CGGAATTCTCCAGGGCGTGGTCAACA-3’；down：5’-GGGGTACCTCTGCTTGATCGCCTCCG-3’，利用PrimeSTARG×LDNA扩增酶进行目的片段扩增。得到的扩增产物与过表达载体pEX18同时进行EcoRⅠ、KpnⅠ限制性酶酶切，将双酶切后的扩增产物与双酶切后的载体pEX18置于16℃进行过夜连接，最后构建成产酶溶杆菌过表达载体pEX18-W。利用双酶切检测的方法对过表达载体pEX18-W中的目的基因进行检测，凝胶电泳结果显示目的基因的大小长度符合。凝胶电泳检测结果如附图4所示。实施例3：产酶溶杆菌过表达载体pEX18-W-P的构建。用已报道的产酶溶杆菌本源启动子进行momL异源表达，均不能达到蛋白的稳定高效表达。利用前期转录组学数据，筛选到启动子PgroEL。将其与已报到的本源启动子进行对比，发现PgroEL能够实现momL的稳定高量表达(表1)。具体方法如下：选取产酶溶杆菌本源groEL基因前端的启动子作为外源基因前端紧密连接的启动子，利用软件PrimerPremier5设计分别带有KpnⅠ、BamHⅠ限制性酶酶切位点的上、下引物，up：5’-GGGGTACCCGATGCCTTTGTGCCAG-3’；down：5’-CGGGATCCGGCGACCTCTGTAAGTAATTG-3’，利用PrimeSTARDNA扩增酶进行启动子片段扩增。得到的扩增产本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组产酶溶杆菌，该重组产酶溶杆菌携带有用于重组表达群体感应淬灭酶MomL基因的重组载体，该重组载体的启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

【技术特征摘要】
1.一种重组产酶溶杆菌，该重组产酶溶杆菌携带有用于重组表达群体感应淬灭酶MomL基因的重组载体，该重组载体的启动子的核苷酸序列为SEQIDNO:1。2.如权利要求1所述的重组产酶溶杆菌，其特征在于，所述的群体感应淬灭酶MomL，其氨基酸序列为SEQIDNO:2。3.权利要求1所述的重组产酶溶杆菌在植物病害防治和制备植物病害防治的生物制品中的应用。4.一种植物病害防治的生物制品，其特征在于，所述的制品包含有权利要求1所述的重组产酶溶杆菌和改造后的群体感应淬灭酶MomL。5.如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：王岩，张晓华，李慧，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东,37