皱纹盘鲍超氧化物歧化酶及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种皱纹盘鲍超氧化物歧化酶及其制备方法和应用。本发明专利技术公开了一种皱纹盘鲍超氧化物歧化酶基因，含有SEQ ID NO.1所述的碱基序列或含有编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：(a)由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有超氧化物歧化酶活性的由(a)衍生的蛋白质。同时公开了该基因所编码的蛋白质和重组载体，以及所述超氧化物歧化酶的制备方法。本发明专利技术借助基因工程技术，获得了超氧化物歧化酶，该蛋白具有很强的清除超氧阴离子自由基、羟自由基、安全性和损伤修复等活性，将在食品添加剂、药物制备和化妆品等领域中发挥应用价值。

Superoxide dismutase of abalone Haliotis discus ino and preparation method and application thereof

The present invention relates to a wrinkled abalone superoxide dismutase and a preparation method and application thereof. The invention discloses an abalone superoxide dismutase gene containing the SEQ sequence ID NO.1 the following encoding or containing protein (a) or (b) gene (a) consisting of amino acid sequences shown by SEQ ID NO.2 protein (b) in; (a) the amino acid sequence determined through substitution, deletion or addition of one or several amino acids and the activity of superoxide dismutase (a) protein derived from. Also disclosed are proteins encoded by the gene and recombinant vectors, and a process for the preparation of the superoxide dismutase. The present invention by genetic engineering technology, the superoxide dismutase, the protein has strong scavenging superoxide anion radicals, hydroxyl radicals, safety and injury repair activity, will play the application in the field of food additives, pharmaceutical preparation and cosmetics etc..

【技术实现步骤摘要】
皱纹盘鲍超氧化物歧化酶及其制备方法和应用
本专利技术涉及酶及其编码的基因与应用，特别涉及一种皱纹盘鲍的基因工程表达，具体涉及一种皱纹盘鲍超氧化物歧化酶HdhCu/ZnSOD及其制备方法和应用。
技术介绍
超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase，SOD)是一类广泛存在动植物以及微生物体内的酸性金属酶。根据不同的金属辅基又可分为铜锌超氧化物歧化酶(Cu/ZnSOD)、锰超氧化物歧化酶(MnSOD)、铁超氧化物歧化酶(FeSOD)和镍超氧化物歧化酶(NiSOD)。其在体内的作用是清除外源性和内源性物质引起的自由基、抑制脂质过氧化和延缓机体衰老等，起到保护生物体的效果。能催化H2O2形成水和氧气，表现出一定的抗氧化能力来清除羟氧自由基等活性氧。其具有一定的清除体内自由基的能力，可作为添加剂、营养强化剂以及保鲜剂等用途应用于化妆品、食品、医药等行业。皱纹盘鲍(H.discushannaiIno)隶属于软体动物门(Mollusca)、腹足纲(Gastropoda)、前鳃亚纲(Prosobranchia)、原始腹足目(Archaeogastropoda)、鲍科(Haliotidae)，以其丰富的营养价值在民间一直被认为是与鱼翅、燕窝齐名的营养食品。目前，已有的对鲍药用及食用价值的研究主要集中在多肽与多糖的提取制备及其生物活性研究。海洋生物因其特殊的生活环境和代谢方式，体内存在许多具有药用价值的特殊生理活性物质，是开发新型海洋药物和功能食品的重要资源。福建省皱纹盘鲍资源丰富、产量大，至2013年，鲍产量达到88470t，所占比例超过全国产量的80％。鲍产业已成为福建省海水养殖的支柱产业之一，也是水产业增长速度最快、经济效益最好的产业。如何充分高效地利用鲍资源，挖掘其中的生物活性物质往保健食品和海洋药物方向高值化利用，符合我省和我国当今新兴的海洋战略发展研究。由于生物体内天然SOD含量极低，直接分离提取工艺相对复杂；而化学合成成本过高且难以保持其天然结构。基因工程以及蛋白质工程的应用为获得天然活性肽开辟了有效途径。基因工程制备生物活性肽克服了直接从动、植物原料中提取抗氧化肽筛选水解酶类的盲目性，纯化工艺简单，便于规模化生产，具有很好的产业化前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供皱纹盘鲍超氧化物歧化酶HdhCu/ZnSOD的制备方法以其在制备食品添加剂和化妆品等领域的应用。具体而言，本专利技术提供了如下技术方案：一方面，本专利技术提供了一种编码皱纹盘鲍超氧化物歧化酶的基因，含有SEQIDNO.1所述的碱基序列或者含有编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：(a)由SEQIDNO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有超氧化物歧化酶活性的由(a)衍生的蛋白质。优选的，用于所述基因扩增的引物如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。本专利技术还提供了一种皱纹盘鲍超氧化物歧化酶，含有以上所述的编码超氧化物歧化酶的基因所编码。本专利技术也提供了一种表达皱纹盘鲍超氧化物歧化酶基因的载体，所述载体为含有权利要求1所述的超氧化物歧化酶基因、AOX1启动子和终止子序列、多克隆位点以及筛选标志的毕赤酵母表达载体，所述毕赤酵母表达载体优选为pPIC9K。优选的，以上所述的载体中，所述超氧化物歧化酶基因位于毕赤酵母表达载体pPIC9K的多克隆位点处EcoRⅠ和NotⅠ限制性内切酶酶切位点之间。优选的，以上所述的载体中，所述筛选标志为6×His-tag标签。本专利技术同时还提供了一种皱纹盘鲍超氧化物歧化酶的制备方法，包括以下步骤：(1)构建含有编码皱纹盘鲍超氧化物歧化酶的基因的重组表达载体；(2)将步骤(1)所得重组表达载体导入宿主细胞，并将宿主细胞进行诱导表达，获得可表达皱纹盘鲍超氧化物歧化酶的基因工程菌菌株；(3)发酵培养已得到的基因工程菌菌株并进行诱导表达，获得表达产物；(4)分离纯化步骤(3)所得的表达产物，获得重组蛋白，皱纹盘鲍超氧化物歧化酶；其中，步骤(1)中所述编码皱纹盘鲍超氧化物歧化酶的基因，含有SEQIDNO.1所述的碱基序列或者含有编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：(a)由SEQIDNO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有超氧化物歧化酶活性的由(a)衍生的蛋白质。优选的，以上所述的制备方法中，步骤(1)中，所述表达载体为毕赤酵母表达载体，优选为pPIC9K。优选的，以上所述的制备方法中，步骤(2)中，所述宿主细胞为毕赤酵母GS115菌株。优选的，以上所述的制备方法中，步骤(3)中，所述分离纯化为先将表达产物进行离心，收集发酵上清液，透析后，再进行亲和层析。优选的，以上所述的制备方法中，步骤(4)中，所述分离纯化为亲和层析法纯化。本专利技术另外还提供了以上所述的皱纹盘鲍超氧化物歧化酶在食品添加剂、药物制备领域或者化妆品领域中的应用。优选的，根据以上所述的应用，所述食品添加剂为动物饲料添加剂，所述皱纹盘鲍超氧化物歧化酶和动物血液的溶血率小于6％。优选的，根据以上所述的应用，所述皱纹盘鲍超氧化物歧化酶相对于PBS溶液，对于正常细胞的存活率维持在80％-110％之间。优选的，根据以上所述的应用，所述皱纹盘鲍超氧化物歧化酶能够保护和修复过氧化氢引起的细胞损伤。本专利技术所取得的有益效果是：本专利技术借助基因工程技术，利用pPIC9K毕赤酵母表达载体，成功高效得在体外表达了可溶的、易纯化分离的、具有抗氧化活性的皱纹盘鲍HdhCu/ZnSOD，该重组蛋白具有很强的清除超氧阴离子自由基、羟自由基等活性。皱纹盘鲍HdhCu/ZnSOD的基因工程表达产品将在制备食品添加剂和化妆品等领域中发挥其应用价值。附图说明图1为PCR扩增HdhCu/ZnSOD目的基因片段。M为DNAMarkerDL2000，其中标号1为HdhCu/ZnSOD基因PCR产物，bp为碱基。图2为SDS-PAGE电泳分析pPIC9K-HdhCu/ZnSOD重组载体转化毕赤酵母GS115菌株后，HdhCu/ZnSOD蛋白的诱导表达图，其中M为预染蛋白Marker26616，标号1-7为重组表达载体pPIC9K-HdhCu/ZnSOD转化毕赤酵母后，甲醇诱导0h，6h，12h，24h，48h，72h，96h蛋白表达产物。图3为SDS-PAGE电泳分析不同甲醇浓度诱导下HdhCu/ZnSOD蛋白的表达图，其中M为预染蛋白Marker26616，标号1-4分别为0.5％体积、1％体积、2％体积、3％体积甲醇浓度诱导下HdhCu/ZnSOD蛋白的表达条带。图4为不同PH条件下HdhCu/ZnSOD的表达图，其中M为预染蛋白Marker26616，标号1-5分别PH为4，5，6，7，8时HdhCu/ZnSOD蛋白的表达条带。图5为SDS-PAGE电泳分析纯化前后HdhCu/ZnSOD的表达图，其中M为预染蛋白Marker26616，标号1-4分别为纯化前HdhCu/ZnSOD蛋白的表达条带，标号5-8为纯化后HdhCu/ZnSOD蛋白的表达条带。图6为HdhCu/ZnSOD蛋白在不同体积分数的Cu离子浓度下的酶活图。图7为HdhCu/ZnSOD蛋白在不同温本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种编码皱纹盘鲍超氧化物歧化酶的基因，其特征在于，含有SEQ ID NO.1所述的碱基序列或者含有编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：(a)由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有超氧化物歧化酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种编码皱纹盘鲍超氧化物歧化酶的基因，其特征在于，含有SEQIDNO.1所述的碱基序列或者含有编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：(a)由SEQIDNO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有超氧化物歧化酶活性的由(a)衍生的蛋白质。2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于，用于所述基因扩增的引物如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。3.一种皱纹盘鲍超氧化物歧化酶，其特征在于，含有权利要求1所述的编码超氧化物歧化酶的基因所编码。4.一种表达皱纹盘鲍超氧化物歧化酶基因的载体，其特征在于，所述载体为含有权利要求1所述的超氧化物歧化酶基因、AOX1启动子和终止子序列、多克隆位点以及筛选标志的毕赤酵母表达载体，所述毕赤酵母表达载体优选为pPIC9K。5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于，所述超氧化物歧化酶基因位于毕赤酵母表达载体pPIC9K的多克隆位点处EcoRⅠ和NotⅠ限制性内切酶酶切位点之间。6.根据权利要求4或5所述的载体，其特征在于，所述筛选标志为6×His-tag标签。7.一种皱纹盘鲍超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建含有编码皱纹盘鲍超氧化物歧化酶的基因的重组表达载体；(2)将步骤(1)所得重组表达载体导入宿主细胞，并将宿主细胞进行诱导表达，获得可表达皱纹盘鲍超氧化物歧化酶的基因工程菌菌株；(3)发酵培养已得到的基因工程菌菌株并...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔琨，刘智禹，方春华，陈贝，潘南，吴婧娜，许旻，蔡水淋，
申请(专利权)人：福建省水产研究所，
类型：发明
国别省市：福建,35