一种锰超氧化物歧化酶基因Mn‑SOD及其应用制造技术

本发明专利技术涉及DNA重组技术领域,特别涉及一种锰超氧化物歧化酶基因Mn‑SOD

A manganese superoxide dismutase gene Mn SOD and its application

The present invention relates to the field of recombinant DNA technology, in particular to a manganese superoxide dismutase gene Mn SOD

【技术实现步骤摘要】
一种锰超氧化物歧化酶基因Mn-SOD及其应用
本专利技术涉及DNA重组
,特别涉及一种锰超氧化物歧化酶基因Mn-SOD,还涉及所述锰超氧化物歧化酶基因Mn-SOD的应用。
技术介绍
活性氧自由基(reactiveoxygenspecies,ROS)是细胞代谢过程中必然产生的一种氧化物，具有高度的化学活性,许多疾病、生命的衰老都涉及到活性氧自由基反应，当体内自由基过多时,它们会导致膜脂过氧化、碱基突变、链的断裂和蛋白质的损伤等。超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase)是一类重要的氧自由基清除剂，通过催化超氧阴离子自由基(O2-)发生歧化反应，减轻或者消除超氧阴离子对机体的氧化或过氧化损害，具有防御氧毒性、增强机体抗辐射损伤能力、防衰老以及治疗某些肿瘤、炎症、自身免疫疾病等功效，广受国内外科研工作者的关注和重视。Mc-cord和Fridovich在1969年发现该酶以来，人们已经从多种动植物和微生物中分离得到此酶。目前，随着对逆境微生物群的研究发展，在极端环境中生存的微生物群中分离得到的SOD酶因其在适应特殊环境方面具有不可比拟的优越性和实用性，逐渐成为SOD研究的新热点，无论基础研究还是应用研究，研究状况十分活跃。Mn-SOD是生物体内重要的氧自由基清除剂。在正常状态下，线粒体电子传递链是超氧化物的主要来源，大约5％的O2分子转变为超氧化物，由于Mn-SOD定位于线粒体，在保护线粒体免受有氧代谢产生的超氧阴离子损伤中发挥重要作用，因此被认为是抵御氧化压力的第一线，Mn-SOD是最有效的具有抗肿瘤活性的抗氧化酶之一，引起国内外生物界和医学界的广大重视。由于高温生物工程环境限制了Mn-SOD的应用，所以人们加强了对酶热稳定性的研究。希望可以通过提高酶作用温度以增加酶热稳定性，从而提高酶作用效率，以达到降低工业生产成本的目的。目前，开发耐热型Mn-SOD的研究主要包括从自然界中嗜热微生物菌株筛选和利用蛋白质工程技术等对酶分子进行定向改造，相对于筛菌技术的盲目性，后者具有更强的针对性，受到国内外学者的青睐。随着基因工程技术、生物信息学等的快速发展，为分子生物学的研究开辟了新的道路。CN104450632A公开了一组可提高SOD耐热温度和热稳定性的氨基酸序列及其应用，它是一组来源于Geobacillus属的13个特殊嗜热Fe/Mn-SOD的N端氨基酸序列。这组氨基酸序列具有以下特征：1)位于Fe/Mn-SOD蛋白的sodA功能域之前，序列长度为101-344个氨基酸，功能未知；2)其相互之间具有85-100％的同源性；3)均包含1或2个特殊的共有重复序列Geo-N-repeat。这组氨基酸序列对Geobacillus属的Fe/Mn-SOD的耐热温度和热稳定性具有决定性作用，可广泛应用于其它SOD(特别是常温SOD)的改造，显著提高其耐热温度和热稳定性。但由于其插入氨基酸序列过大可能会影响后续蛋白的表达纯化等过程，且由于要插入特定氨基酸序列会使实验过程更为复杂。
技术实现思路
为了解决以上现有技术中Mn-SOD热稳定性的问题，本申请提供了一种最适反应温度较高，60℃下的半衰期较长的锰超氧化物歧化酶基因Mn-SODV140L，E155W，E215W。本技术是通过对酶分子进行定向改造以提高热稳定性，改造后的酶分子其热稳定性有了明显提高，且过程简单操作方便，有较大的工业化生产和应用潜力以及经济价值。本专利技术还提供了所述的锰超氧化物歧化酶基因Mn-SODV140L，E155W，E215W的载体的构建方法。本专利技术还提供了所述的锰超氧化物歧化酶基因Mn-SODV140L，E155W，E215W在氧自由基清除中的应用。本专利技术是通过以下步骤得到的：一种锰超氧化物歧化酶基因Mn-SODV140L,E155W,E215W，根据HumanMn-SOD的三维结构(2ADQ)为模板模拟得到MouseMn-SOD三维结构，通过设计突变Val140Leu,Glu155Trp,Glu215Trp得到突变型Mn-SODV140L，E155W，E215W，核苷酸序列如序列表中序列1所示。共突变三个氨基酸，六个碱基突变位点。将第418位碱基g突变为c；将463位碱基g突变为t，将第464位碱基a分别g；将第643位碱基g突变为t，将第644位碱基a突变为g，将第645位碱基a突变为g。所述的锰超氧化物歧化酶基因Mn-SODV140L，E155W，E215W，其氨基酸序列如序列表中序列2所示。将第140位氨基酸Val突变为Leu，第155位氨基酸Glu突变为Trp，第215位氨基酸Glu突变为Trp。所述的锰超氧化物歧化酶基因Mn-SODV140L，E155W，E215W，优选其最适反应温度为39℃，60℃下的半衰期120min。所述的锰超氧化物歧化酶基因Mn-SODV140L，E155W，E215W的载体的构建方法，包括以下步骤：(1)设计突变引物，核苷酸序列如下：SOD2-F:5’-CGCGGATCCATGTTGTGTCGGGCGGCGT-3’，SOD2-R:5’-ACGCGTCGACGTGGCCGTGAGTGAGGTT-3’，T140-F:5’-CTGACAGCCGTGTCTCTGGGAGTCCAAGGT-3’，T140-R:5’-ACCTTGGACTCCCAGAGACACGGCTGTCAG-3’，T155-F:5’-GGCTTCAATAAGTGGCAAGGTCGCTTAC-3’，T155-R:5’-GTAAGCGACCTTGCCACTTATTGAAGCC-3’，T215-R:5’-ACGCGTCGACTCACTTCTTGCAAGCTGTGTATCTCCAAGTAACATTCTCCCAGTTGA-3’，(2)以小鼠血液RNA为模板，以SOD2-F，SOD2-R为引物RT-PCR获得小鼠Mn-SOD基因，将其插入到表达载体pGEX-6p-1的多克隆位点，酶切位点为BamHI、SalI，构建得到重组表达质粒Mn-SOD-pGEX-6p-1；(3)以构建成功的重组质粒Mn-SOD-pGEX-6p-1为模板，以SOD2-F、T140-R为引物进行第一轮PCR，经切胶回收后获得基因片段Mn-SOD1-140；以T140-F、SOD2-R为引物进行第二轮PCR，经切胶回收后获得基因片段Mn-SOD141-222；以SOD2-F、SOD2-R为引物，前两轮PCR产物为模板进行第三轮PCR，获得单点突变型Mn-SODVal140Leu基因，将其插入到表达载体pGEX-6p-1的多克隆位点，酶切位点为BamHI、SalI，构建单点突变型重组表达质粒Mut-Mn-SOD-pGEX-6p-1Val140Leu；(4)以构建成功的单点突变型重组质粒Mn-SOD-pGEX-6p-1Val140Leu为模板，以SOD2-F、T155-R为引物进行第一轮PCR，经切胶回收后获得基因片段Mut-Mn-SOD1-155；以T155-F、SOD2-R为引物进行第二轮PCR，经切胶回收后获得基因片段Mut-Mn-SOD156-222；以SOD2-F、SOD2-R为引物，前两轮PCR产物为模板进行第三轮PCR，获得双点突变型Mut-Mn-SODVal140Leu本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种锰超氧化物歧化酶基因Mn‑SOD

【技术特征摘要】
1.一种锰超氧化物歧化酶基因Mn-SODV140L,E155W,E215W，其特征在于其核苷酸序列如序列表中序列1所示。2.根据权利要求1所述的锰超氧化物歧化酶基因Mn-SODV140L,E155W,E215W，其特征在于其氨基酸序列如序列表中序列2所示。3.根据权利要求1所述的锰超氧化物歧化酶基因Mn-SODV140L,E155W,E215W，其特征在于其最适反应温度为39℃，60℃下的半衰期120min。4.一种含有权利要求1中所述的锰超氧化物歧化酶基因Mn-SODV140L,E155W,E215W的载体的构建方法，其特征在于包括以下步骤：（1）设计突变引物，核苷酸序列如下：SOD2-F:5’-CGCGGATCCATGTTGTGTCGGGCGGCGT-3’，SOD2-R:5’-ACGCGTCGACGTGGCCGTGAGTGAGGTT-3’，T140-F:5’-CTGACAGCCGTGTCTCTGGGAGTCCAAGGT-3’，T140-R:5’-ACCTTGGACTCCCAGAGACACGGCTGTCAG-3’，T155-F:5’-GGCTTCAATAAGTGGCAAGGTCGCTTAC-3’，T155-R:5’-GTAAGCGACCTTGCCACTTATTGAAGCC-3’，T215-R:5’-ACGCGTCGACTCACTTCTTGCAAGCTGTGTATCTCCAAGTAACATTCTCCCAGTTGA-3’，（2）以小鼠血液RNA为模板，以SOD2-F，SOD2-R为引物RT-PCR获得小鼠Mn-SOD基因，将其插入到表达载体pGEX-6p-1的多克隆位点，酶切位点为BamHI、SalI，构建得到重组表达质粒Mn-SOD-pGEX-6p-1；（3）以构建成功的重组质粒Mn-SOD-pGEX-6p-1为...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘金锋，魏贝贝，姜曰水，李杰，刘哲，巩志金，车程川，杨革，
申请(专利权)人：曲阜师范大学，
类型：发明
国别省市：山东,37