一种烯键还原酶及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种烯键还原酶以及制备方法和应用，本发明专利技术提供的烯键还原酶，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，由碱基序列如SEQ ID No.1所示烯键还原酶基因编码。本发明专利技术公开该还原酶或其重组酶作为催化剂在不对称还原共轭C＝C双键以制备光学活性的带吸电子基团饱和化合物中的应用。本发明专利技术提供的重组酶的制备方法简单，可作为催化剂应用于共轭C＝C双键的不对称还原，适用的化合物范围广，具有优异的催化活性，可获得高转化率、高光学纯度的带吸电子基团饱和化合物，且反应条件温和、对环境友好，具有很好的工业应用开发前景。

Alkenyl bond reductase, preparation method and application thereof

The invention discloses a double bond reductase and the preparation method and the application of olefinic bond reductase provided by the invention, amino acid sequence of SEQ ID No.2 shown by nucleotide sequences such as SEQ ID No.1 shown olefinic bond reductase gene encoding. The present invention discloses the use of the reductase or its recombinant enzyme as a catalyst in asymmetric reduction of conjugated C = C double bonds to prepare optically active electron withdrawing group saturated compounds. The preparation method of the recombinant enzyme provided by the invention is simple, can be used as a catalyst in the asymmetric reduction of conjugated C = C bond, applicable to a wide range of compounds, has excellent catalytic activity, can achieve a high conversion rate, high optical purity with electron withdrawing saturated compounds, and the reaction condition was mild and friendly to the environment. Has a good prospect of industrial application development.

【技术实现步骤摘要】
一种烯键还原酶及其制备方法和应用
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种烯键还原酶，及其制备方法和应用。
技术介绍
在生物催化领域，高效催化的酶对催化反应的进行是至关重要的。烯键还原酶(enoatereductases，ERs)作为一类受到广泛关注的新型酶，能够高选择性地还原碳碳双键，近年来对其高效催化酶源的研究成为热点。带有吸电子基团的饱和化合物是医药、激素、香料、以及农药生产等方面的重要物质，常常需要由其α,β-不饱和化合物选择性还原获得，但吸电子基团易使烯烃钝化，对其进行选择性还原是一个富有挑战性的课题。化学合成中最常用过渡金属及其络合物对该类化合物还原，此法存在成本高，条件苛刻，产率低、会污染环境等缺点。研究表明，生物界中的烯键还原酶能够还原碳碳双键，且选择性高，产率好，条件温和，是一条环境友好的合成途径。目前对于能够进行高效催化的烯键还原酶种类研究还很少，几乎没有可以用于工业生产应用的。在工业上，红球菌属是一个非常具有商业价值的细菌类群，许多菌株参与了氨基酸如L2亮氨酸和L2苯丙氨酸的生产以及固醇类的转化。目前红球菌的研究主要集中在腈水解酶应用上，应用范围窄。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种可用于工业生产应用的烯键还原酶，包含所述烯键还原酶基因的烯键还原酶重组表达载体或烯键还原酶重组表达转化体；本专利技术另一目的是提供一种制备重组烯键还原酶的方法；本专利技术还提供一种将烯键还原酶或重组烯键还原酶应用于烯键的还原，例如α,β-不饱和化合物中C＝C双键的还原，特别是α,β-不饱和化合物中C＝C双键的不对称还原。为了实现本专利技术的目的，一方面，本专利技术提供一种烯键还原酶基因，其碱基序列如SEQIDNo.1所示。所述烯键还原酶基因制备步骤如下：通过引物，以紫红色红球菌RhodococcusrhodochrousATCC17895的基因组为模板，经聚合酶链式反应(PCR)进行基因扩增得碱基序列如SEQIDNo.1所示的烯键还原酶基因。一方面，本专利技术提供一种本专利技术所述的烯键还原酶基因编码的烯键还原酶，其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。进一步地，本专利技术所述的烯键还原酶，所述的烯键还原酶的GenBank登录号为：KT321320，下文也简称烯键还原酶为RhER2718，其来源于紫红色红球菌(Rhodococcusrhodochrous)ATCC17895。另一方面，本专利技术提供一种包含碱基序列如SEQIDNo.1所示的烯键还原酶基因的烯键还原酶重组表达载体。所述烯键还原酶重组表达载体的制备方法如下：将碱基序列如SEQIDNo.1所示的烯键还原酶基因通过酶切后连接于载体上，即可。所述的载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选质粒pET28a(+)。较佳的，可通过下述方法制得本专利技术的烯键还原酶重组表达载体：将碱基序列如SEQIDNo.1所示的烯键还原酶基因和质粒pET28a(+)用限制性内切酶NdeI和HindIII双酶切，然后用T4DNA连接酶连接，即可得本专利技术的烯键还原酶重组表达载体。进一步地，本专利技术所述的烯键还原酶重组表达载体，其骨架为pET28a(+)。另一方面，本专利技术提供一种烯键还原酶重组表达转化体，其包含本专利技术所述烯键还原酶的基因、或本专利技术所述的烯键还原酶重组表达载体。进一步地，本专利技术所述的烯键还原酶重组表达载体，制备步骤如下：首先，通过引物，以紫红色红球菌RhodococcusrhodochrousATCC17895的全基因组为模板，经聚合酶链式反应进行基因扩增得碱基序列如SEQIDNo.1所示的烯键还原酶基因，之后连接于载体(所述的载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选质粒pET28a(+))上得包含SEQIDNo.1所示的烯键还原酶基因的烯键还原酶重组表达载体；将本专利技术所述的烯键还原酶基因重组表达载体转化至宿主微生物中制得。进一步地，本专利技术所述的烯键还原酶重组表达转化体，其中，所述的引物为：上游引物为GGAATTCCATATGGTTGCAGTAAAGCCTT(如SEQIDNo.3所示)，下游引物为CCCAAGCTTTTACGCCTTGGTATCAATAG(如SEQIDNo.4所示)。另一方面，本专利技术提供一种烯键还原酶重组表达转化体，其通过将本专利技术所述的烯键还原酶基因重组表达载体转化至宿主微生物中制得。进一步地，本专利技术所述的烯键还原酶重组表达转化体，其中，所述的宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足重组表达载体可稳定的自行复制，且所携带的本专利技术的烯键还原酶基因可被有效表达即可；优选地，所述的宿主微生物为大肠杆菌。进一步地，本专利技术所述的烯键还原酶重组表达转化体，其中，进一步优选地，所述的宿主微生物为大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)。一方面，本专利技术提供一种包含本专利技术所述烯键还原酶基因的重组菌或转基因细胞系。进一步地，所述烯键还原酶基因通过导入宿主菌或细胞制得重组菌或转基因细胞系。一方面，本专利技术提供一种重组烯键还原酶的制备方法，其通过培养本专利技术所述的烯键还原酶重组表达转化体，获得重组烯键还原酶。所述重组烯键还原酶的制备方法中，所述培养的步骤的方法和条件没有特殊限制，可以根据宿主类型和所选培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要使重组表达转化体能够生长并产生本专利技术的重组烯键还原酶即可。进一步地，本专利技术所述的制备方法，将包含碱基序列如序列表中SEQIDNo.1所示的烯键还原酶的重组大肠杆菌(重组表达转化体)接种于含卡那霉素的LB培养基中培养；当培养液的光密度OD600达到0.5-0.6，在终浓度为0.1-1.0mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的诱导下，即可高效表达重组烯键还原酶。进一步地，本专利技术所述的制备方法，优选培养液的光密度OD600达到0.55时，在终浓度为0.5mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的诱导下，即可高效表达重组烯键还原酶。进一步地，本专利技术所述的制备方法，所述诱导的时间优选20-30℃，更优选为22℃。所述诱导的时间优选15-25h，更优选20h。进一步地，本专利技术所述的制备方法，所述的LB培养基包括酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl10g/L，pH7.0。进一步地，按照本专利技术所述的制备方法，高效表达重组烯键还原酶后，可按本领域常规方法收集待用，一般可为下述方法中任一种：(1)收集培养液中的细胞、洗涤、冷冻干燥、得冻干细胞，具体的操作步骤优选：将培养液离心(转速一般为8000-10000rpm)去除上清液，收集细胞，生理盐水洗涤(优选2次)，冷冻干燥，得冻干细胞。(2)将收集的培养液中的细胞进行细胞破壁处理、离心、取上清液、即得粗酶液，具体的操作步骤优选：将收集的培养液中的细胞重新悬浮于本领域常用的pH6.5-7.5的缓冲液(如磷酸盐缓冲液，优选pH7.0，50mmol/L的磷酸-磷酸钾缓冲液)中，进行细胞破壁。所述的细胞破壁的方法可采用常规方法，如超声处理，优选条件为功率400W，超声4s，间歇6s，重复99轮。细胞破壁后的离心的速度较佳的为8000-10000rpm。(3)按方式(2)制备粗酶液，将粗酶液进一步冷冻干燥的粗酶液。一本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种烯键还原酶基因，其特征在于：其碱基序列如SEQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种烯键还原酶基因，其特征在于：其碱基序列如SEQIDNo.1所示。2.权利要求1所述的烯键还原酶基因编码的烯键还原酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。3.包含如权利要求1所述的烯键还原酶基因的烯键还原酶重组表达载体。4.一种烯键还原酶重组表达转化体，其特征在于：其包含如权利要求1所述的烯键还原酶基因、或如权利要求3所述的烯键还原酶重组表达载体。5.如权利要求4所述的烯键还原酶重组表达转化体，其特征在于：所述的烯键还原酶重组表达转化体由下述方法制得：通过引物，以紫红色红球菌RhodococcusrhodochrousATCC17895的全基因组为模板，经聚合酶链式反应进行基因扩增，得碱基序列如SEQIDNo.1所示的烯键还原酶基因，之后将烯键还原酶基因连接于载体上得包含SEQIDNo.1所示的烯键还原酶基因的重组表达载体；将所得烯键还原酶重组表达载体转化至宿主微生物中制得的异源表达菌株，即获得烯键还原酶重组表达转化体。6.如权利要求5所述的烯键还原酶重组表达转化体，其特征在于：所述的引物为：上游引物为GGAATTCCATATGGTTGCAGTAAAGCCTT，下游引物为CCCAAGCTTTTACGCCTTGGTATCAATAG；所述的宿主微生物为大肠杆菌；所述的载体为质粒pET28a(+)。7.一种重组烯键还原酶的制备方法，其特征在于，通过培养如权利要求4～6任一所述的烯键还原酶重组表达转化体，获得重组烯键还原酶。8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，将如权利要求4～6任一所述的烯键还原酶重组表达转化体接种至含卡那霉素的LB培养基中培养；当培养液的光密度OD600达到0.5-0.6，在终浓度为0.1-1.0mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的诱导下，即得高效表达的重组烯键还原酶。9.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的LB培...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈碧双，刘岚，刘慧，杨振男，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东,44