用于还原苯乙酮的酮还原酶多肽制造技术

本公开提供了与天然存在的野生型酮还原酶相比具有改进特性的工程酮还原酶。还提供了编码工程酮还原酶的多核苷酸、能表达工程酮还原酶的宿主细胞和使用工程酮还原酶来合成多种手性化合物的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于还原苯乙酮的酮还原酶多肽1.相关申请的交叉引用本申请根据35U. S. C. § 119 (e)要求2007年9月13日提交的申请序列第 60/972，058号的利益，其内容通过引用并入本文。2.序列表、表格或计算机程序的引用作为文件名376247-017. txt通过EFS_Web以计算机可读形式(CRF)根据37C. F.R. §1.821随本申请同时提交的序列表通过引用并入本文。序列表的电子拷贝产生在 2008年9月13日，文件大小为213千字节。3.背景属于酮还原酶(KRED)或羰基还原酶类(EC 1. 1. 1. 184)的酶可用于从对应的前 体立体异构酮底物和通过对应的消旋醛底物的立体专一性还原来合成光学上有活性的醇 类。KRED —般将酮和醛底物转化为对应的醇产物，但是还可催化相反的反应，将醇底物氧 化为对应的酮/醛产物。通过诸如KRED的酶来还原酮和醛以及氧化醇需要辅因子，最常 见的辅因子是还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADPH)，以及用于氧化反应的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷 酸(NADP)。NADH和NADPH作为电子供体，而NAD和NADP作为电子受体。常常观察到酮还 原酶和醇脱氢酶接受磷酸化或非磷酸化辅因子(以其氧化和还原状态)，但不是两者。KRED酶可发现于多种细菌和酵母中(综述参见Kraus和Waldman，1995， Enzyme catalysis in organic synthesis (有机合成中的酶催化)，第 1&2 卷 VCH ffeinheim ；Faber, K. ,2000, Biotransformations in organic chemistry (有机化学中 的生物转化)，第 4 版，Springer, Berlin Heidelberg New York ；和 Hummel 和 Kula， 1989，Eur. J. Biochem. 184 :1_13)。已报道几种KRED基因和酶序列，例如，木兰假丝 酵母(Candida magnoliae) (Genbank 登录号 JC7338 ;GI 11360538)、近平滑假丝酵母 (Candida parapsilosis) (Genbank 登录号 BAA24528. 1 ；GI 2815409)、赭色掷孢酵母 (Sporobolomycessalmonicolor) (Genbank 登录号 AF160799 ；GL6539734)。为了避免用于产生关键化合物的许多化学合成过程，增加地采用酮还原酶以将不 同的酮和醛底物酶促转化为手性醇产物。这些应用可采用表达酮还原酶的全细胞用于生物 催化酮和醛的还原，或在其中全细胞中多种酮还原酶的存在将相反地影响需要产物的立体 纯度和产量的那些实例中通过使用纯化的酶。对体外应用，使用诸如葡萄糖脱氢酶(GDH)、 甲酸脱氢酶等的辅因子(NADH或NADPH)再生酶与酮还原酶的组合。使用酮还原酶来产生 有用的化学化合物的实例包括4-氯乙酰乙酸酯类的不对称还原(Zhou，1983，J. Am. Chem. Soc. 105 5925-5926 ；Santaniello, J. Chem. Res. (S) 1984 :132-133 ；美国专利第 5，559，030 号；美国专利第5，700, 670号和美国专利第5，891，685号)、二氧羧酸类的还原(例如，美 国专利第6，399，339号)、(S)氯代_5_羟基-3-氧代己酸叔丁酯的还原(例如，美国专利 第6，645，746和W0 01/40450号)、基于吡咯并三嗪的化合物的还原(例如，美国申请第 2006/0286646号)；取代苯乙酮的还原(例如，美国专利第6，800，477号)；和酮四氢噻吩 (ketothiolane)的还原(W0 2005/054491)。10需要鉴定可用来将各种酮底物转化为其对应的手性醇产物的其他酮还原酶。4.概述本公开提供了能将确定的酮底物立体选择性地还原为其对应醇产物、并且当与获 自克菲尔乳杆菌(L. kefir) (SEQ ID NO :4)或短乳杆菌(L. brevis) (SEQ ID NO 2)或小 乳杆菌(L. minor) (SEQ ID NO :98)的天然存在的野生型KRED酶相比时或当与其他工程 酮还原酶相比时具有改进特性的工程酮还原酶(“KRED”)。本公开中显示来自乳杆菌种 (Lactobacillus species)的天然存在的酮还原酶将化合物苯乙酮还原为(R)_l_苯乙醇。 因为野生型酶一般选择性地用于将苯乙酮还原为其对应的(R)_醇，这些天然存在的酶是 (R)-选择性酮还原酶或(R)-酮还原酶。对取代苯乙酮(诸如2' ,6' -二氯-3'-氟苯 乙酮)，这些野生型克菲尔乳杆菌或短乳杆菌或小乳杆菌酮还原酶表现出对取代苯乙酮底 物的不明显的活性，如果有活性的话。然而，衍生自野生型乳杆菌种的酮还原酶的本公开的 工程酮还原酶能将苯乙酮还原为(S)-l-苯乙醇。因此本文所述的酮还原酶通过与用于还 原苯乙酮的野生型克菲尔乳杆菌或短乳杆菌或小乳杆菌酮还原酶相比反向的对映选择性 来表征。因此本公开的这些多肽称为(S)-选择性酮还原酶或(S)-酮还原酶。反向对映选 择性是基于将野生型酮还原酶190位置的残基(即X190)突变为不是酪氨酸的残基，优选 地突变为非芳族残基，特别地突变为脯氨酸残基。此外，除了改变的立体选择性外，本文所述的工程酶可具有一种或多种改进的特 性。例如，与野生型酮还原酶相比，工程酮还原酶多肽可具有改进的酶促活性用于将底物还 原为产物和/或进一步增强对(S)对映体的立体选择性。酶特性的改进还可包括但不限于 热稳定性、溶剂稳定性的增强或降低的产物抑制。如本文进一步公开的，尽管野生型酮还 原酶在还原取代苯乙酮中显示不明显的活性，本公开提供了能将取代苯乙酮2' ,6' -二 氯-3'-氟苯乙酮还原或转化为(S)-l-[2，6-二氯-3-氟苯基]-乙醇的酮还原酶。相应地，在一些实施方案中，本公开涉及在对应于SEQ ID N0:2、4或98的X190的 残基处具有不是酪氨酸的残基的酮还原酶多肽。在一些实施方案中，该残基是非芳族残基， 诸如，例如脂肪族、受限、非极性或半胱氨酸残基。在一些实施方案中，该残基是脯氨酸。除了在对应于X190的残基处的特点，与SEQ ID NO :2、4或98的序列相比，该酮 还原酶可在其他残基位置具有一个或多个残基的差异。在一些实施方案中，本文的酮还 原酶多肽包含与基于SEQ ID而2、4或98的参考序列相比具有至少约85%、86%、87%、 88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高同一性的氨基 酸序列，其在对应于X190的残基处具有非芳族残基，包括脂肪族、受限、非极性或半胱氨酸 残基，特别是丙氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸或脯氨酸，条件是该酮还原酶多肽在对应于X190 的残基处具有不是酪氨酸的残基，特别是非芳族残基。在一些实施方案中，该酮还原酶多肽 具有其中对应于X190本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酮还原酶多肽，该多肽能以至少约８５％的百分比立体异构过量将２′，６′－二氯－３′－氟苯乙酮底物立体选择性地还原为产物（Ｓ）－１－（２，６－二氯－３－氟苯基）乙醇。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2007-9-13 60/972,058一种酮还原酶多肽，该多肽能以至少约85％的百分比立体异构过量将2′，6′-二氯-3′-氟苯乙酮底物立体选择性地还原为产物(S)-1-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇。2.如权利要求1所述的多肽，该多肽包含与基于SEQID N0:2、4或98的在对应于X190 的残基处具有脯氨酸的参考序列具有至少约85%同一性的氨基酸序列，条件是所述酮还原 酶的氨基酸序列在对应于X190的残基处具有非芳族残基。3.如权利要求2所述的多肽，其中所述酮还原酶的氨基酸序列在对应于X190的残基处 具有脂肪族、非极性、受限或半胱氨酸残基。4.如权利要求2所述的多肽，其中所述酮还原酶的氨基酸序列在对应于X190的残基处 具有脯氨酸。5.如权利要求2所述的多肽，其中所述酮还原酶包含另外具有一种或多种以下特点的氨基酸序列对应于X7的残基是芳族、非极性、极性、受限或碱性残基；对应于X16的残基是极性残基；对应于X43的残基是非极性或极性残基；对应于X60的残基是芳族或非极性或脂肪族残基；对应于X94的残基是半胱氨酸、非极性或脂肪族残基；对应于X95的残基是非极性或脂肪族残基；对应于X96的残基是极性或酸性残基；对应于X97的残基是极性、非极性、脂肪族或碱性残基；对应于X120的残基是芳族、非极性或脂肪族残基；对应于X125的残基是极性或非极性残基；对应于X142的残基是极性残基，特别是丝氨酸或天冬酰胺；对应于X147的残基是芳族、极性、非极性或脂肪族残基；对应于X149的残基是非极性或芳族残基；对应于X150的残基是受限或酸性残基；对应于X152的残基是非极性或极性残基；对应于X196的残基是脂肪族、非极性或芳族残基；对应于X202的残基是脂肪族、芳族或非极性残基；对应于X205的残基是碱性、非极性或脂肪族残基；对应于X206的残基是非极性或芳族残基；并且其中任选地所述氨基酸序列与所述参考序列相比在其他氨基酸残基处具有一个或多 个残基差异。6.如权利要求2所述的多肽，该多肽包含另外具有一种或多种以下特点的氨基酸序列对应于X7的残基是苏氨酸、脯氨酸、色氨酸、精氨酸、组氨酸或天冬酰胺；对应于X16的残基是丝氨酸；对应于X43的残基是异亮氨酸；对应于X60的残基是丙氨酸；对应于X94的残基是丙氨酸、缬氨酸或半胱氨酸；对应于X95的残基是异亮氨酸或亮氨酸；对应于X96的残基是丝氨酸、天冬酰胺、苏氨酸或谷氨酸；对应于X97的残基是赖氨酸、苏氨酸、缬氨酸、精氨酸、甲硫氨酸或异亮氨酸；对应于X120的残基是苯丙氨酸或缬氨酸；对应于X125的残基是甘氨酸或丝氨酸；对应于X142的残基是天冬酰胺；对应于X147的残基是苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸或谷氨酰胺；对应于X149的残基是甘氨酸或苯丙氨酸；对应于X150的残基是天冬氨酸或组氨酸；对应于X152的残基是丝氨酸、苏氨酸或甲硫氨酸；对应于X196的残基是缬氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或异亮氨酸；对应于X202的残基是丙氨酸、色氨酸、酪氨酸或甲硫氨酸；对应于X205的残基是精氨酸；对应于X206的残基是甲硫氨酸或酪氨酸；并且其中任选地所述氨基酸序列与所述参考序列相比在其他氨基酸残基处具有一个或多 个残基差异。7.如权利要求2所述的多肽，该多肽包含具有一种或多种以下特点的氨基酸序列 对应于X147的残基是芳族、极性、非极性或脂肪族残基，对应于X202的残基是脂肪族、芳族或非极性残基；并且其中任选地所述氨基酸序列与所述参考序列相比在其他氨基酸残基处具有一个或多 个残基差异。8.如权利要求2所述的多肽，该多肽包含具有一种或多种以下特点的氨基酸序列 对应于X7的残基是芳族、非极性、极性、受限或碱性残基；对应于X147的残基是芳族、极性、非极性或脂肪族残基； 对应于X202的残基是脂肪族、芳族或非极性残基；并且其中任选地所述氨基酸序列与所述参考序列相比在其他氨基酸残基处具有一个或多 个残基差异。9.如权利要求2所述的多肽，该多肽包含具有一种或多种以下特点的氨基酸序列 对应于X7的残基是芳族、非极性、极性、受限或碱性残基，对应于X97的残基是极性、非极性、脂肪族或碱性残基 对应于X147的残基是芳族、极性、非极性或脂肪族残基； 对应于X202的残基是脂肪族、芳族或非极性残基；并且其中任选地所述氨基酸序列与所述参考序列相比在其他氨基酸残基处具有一个或多 个残基差异。10.如权利要求2所述的多肽，该多肽包含具有一种或多种以下特点的氨基酸序列 对应于X94的残基是半胱氨酸、非极性或脂肪族残基；对应于X96的残基是极性或酸性残基；对应于X147的残基是芳族、极性、非极性或脂肪族残基；特别是谷氨酰胺、异亮氨酸或 亮氨酸；并且其中任选地所述氨基酸序列与所述参考序列相比在其他氨基酸残基处具有一个或多 个残基差异。11.如权利要求2所述的多肽，该多肽包含具有一种或多种以下特点的氨基酸序列对应于X7的残基是芳族、非极性、极性、受限或碱性残基；对应于X147的残基是芳族、极性、非极性或脂肪族残基；对应于X196的残基是脂肪族、非极性或芳族残基；对应于X202的残基是脂肪族、芳族或非极性残基；并且其中任选地所述氨基酸序列与所述参考序列相比在其他氨基酸残基处具有一个或多 个残基差异。12.如权利要求2所述的多肽，该多肽包含具有一种或多种以下特点的氨基酸序列对应于X147的残基是芳族、极性、非极性或脂肪族残基；对应于X196的残基是脂肪族、非极性或芳族残基；对应于X202的残基是脂肪族、芳族或非极性残基；并且其中任选地所述氨基酸序列与所述参考序列相比在其他氨基酸残基处具有一个或多 个残基差异。13.如权利要求1所述的多肽，其中所述百分比立体异构过量为至少约90%。14.如权利要求1所述的多肽，其中所述百分比立体异构过量为至少约99%。15.如权利要求14所述的多肽，该多肽包含选自SEQID NO :6，8，10，12，14，16，18，20， 22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70， 72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92 和 94 的氨基酸序列。16.如权利要求1所述的多肽，其中所述多肽进一步能以比具有SEQIDNO :6的序列的 酮还原酶多肽所能达到的速率更高的速率将所述底物还原为所述产物。17.如权利要求16所述的多肽，该多肽包含选自SEQID NO :8，10，12，14，16，18，20， 22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70， 72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92 和 94 的氨基酸序列。18.如权利要求4所述的多肽，其中所述多肽进一步能以比具有SEQIDNO :6的序列的 酮还原酶多肽所能达到的速率高至少约450%的速率将所述底物还原为所述产物。19.如权利要求18所述的多肽，所述多肽包含选自SEQID NO :8，10，14，16，18，22，24， 26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80， 82，84，86，88，90，92和94的氨基酸序列。20.如权利要求4所述的多肽，其中所述多肽进一步能以比具有SEQIDNO :6的序列的 酮还原酶多肽所能达到的速率高至少约1500%的速率将所述底物还原为所述产物.21.如权利要求21所述的多肽，该多肽包含选自SEQID NO 18，32，34，36，38，40，42， 44，46，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92 和 94 的氨基酸序列。22.如权利要求4所述的多肽，当使用相对2',6' -二氯-3'-氟苯乙酮底物的量 按重量计小于约1 %的量的所述多肽进行时，该多肽能在不到约24小时内将至少约95%的 2' ,6' -二氯-3'-氟苯乙酮底物转化为(S)-l-(2，6-二氯-3-氟苯基)乙醇。23.如权利要求22所述的多肽，该多肽包含选自SEQID NO 18，32，34，36，38，40，42， 44，46，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92 和 94 的氨基酸序列。24.—种酮还原酶多肽，该多肽包含具有与基于SEQ ID NO :2，4或98的、在对应于X190 的残基处为脯氨酸的参考序列的残基90至211具有至少约85%同一性的氨基酸序列的结 构域，条件是所述酮还原酶多肽的氨基酸序列在对应于X190的残基处为非芳族残基。25.如权利要求24所述的多肽，其中所述酮还原酶的结构域包含其中对应于X190的残 基为脂肪族、非极性、受限或半胱氨酸残基的氨基酸序列。26.如权利要求24所述的多肽，其中所述酮还原酶的结构域包含其中对应于X190的残 基为脯氨酸的氨基酸序列。27.如权利要求24所述的多肽，其中所述酮还原酶多肽的结构域包含具有一种或多种 以下特点的氨基酸序列对应于X94的残基是半胱氨酸、非极性或脂肪族残基；对应于X95的残基是非极性或脂肪族残基；对应于X96的残基是极性或酸性残基；对应于X97的残基是极性、非极性、脂肪族或碱性残基；对应于X120的残基是芳族、非极性或脂肪族残基；对应于X125的残基是极性或非极性残基；对应于X142的残基是极性残基，特别是丝氨酸或天冬酰胺；对应于X147的残基是芳族、极性、非极性或脂肪族残基；对应于X149的残基是非极性或芳族残基；对应于X150的残基是受限或酸性残基；对应于X152的残基是非极性或极性残基；对应于X196的残基是脂肪族、非极性或芳族残基；对应于X202的残基是脂肪族、芳族或非极性残基；对应于X205的残基是碱性、非极性或脂肪族残基；对应于X206的残基是非极性或芳族残基；并且其中所述氨基酸序列与所述参考序列相比在对应于残基90-211的结构域的其他氨基 酸残基处可任选地具有一个或多个差异。28.如权利要求24所述的多肽，其中对应于残基90-211的所述酮还原酶多肽的结构域 包含具有一种或多种以下特点的氨基酸序列对应于X94的残基是丙氨酸、缬氨酸或半胱氨酸；对应于...

【专利技术属性】
技术研发人员：杰克梁，史提芬尼J珍妮，艾米丽穆德弗，沙琳奇恩，约翰M格鲁伯，安克克莱伯，古伽特W哈思曼，
申请(专利权)人：科德克希思公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]