本发明专利技术公开了一个来源于桑树的查尔酮异构酶基因MaCHI的序列、克隆方法及应用。该基因全长2112bp，含4个外显子和3个内含子，开放阅读框（ORF）全长为660bp，编码219个氨基酸，包括290bp的3′端非编码区。该基因为植物类黄酮合成路径中的关键基因之一，采用基因工程的方法，将其导入桑树中，实现过表达，可提高桑树各组织中类黄酮的含量。该发明专利技术还可以应用到其他植物中，改变植物体内类黄酮的含量及种类，降低从植物中提取类黄酮的成本，有利于促进类黄酮物质在医药产业中的开发利用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物基因工程领域，特别是涉及桑树类黄酮化合物生物合成关键基因查尔酮异构酶基因及其应用。
技术介绍
类黄酮是一类重要的植物次生代谢物质， 是由两个苯环通过中央三碳链相互联结而成的一系列化合物，小部分以游离形式存在，大部分与糖类合成苷类，以配基形式存在。桑树中类黄酮化合物种类丰富、分布广泛，主要有花色素、黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮醇类等四大类，药理研究证明桑树类黄酮化合物具有良好的抗氧化、降血糖、抗病菌、降血压、降血脂等功能。类黄酮合成途径中，查尔酮异构酶基因^///是极为关键的限速酶，控制类黄酮的合成和组分分化，因此桑树查尔酮异构酶基因可应用于桑树类黄酮生物合成的调控。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供桑树查尔酮异构酶基因核苷酸全序列、桑树查尔酮异构酶基因开放阅读框ORF序列及3'端非编码区、桑树查尔酮异构酶基因编码的氨基酸序列，以及在此序列基础上进行密码子优化或点突变所产生的与原始序列相似度在90%以上的序列。针对桑树中类黄酮含量较低、提取成本高的困难，提供一个调控桑树类黄酮生物合成的基因以及在转基因植物中的应用。本专利技术所述的桑树查尔酮异构酶基因全长的克隆，依次通过以下步骤实现 1)根据蔷薇科植物草莓或苹果的查尔酮异构酶基因保守序列设计兼并引物，以桑树叶片基因组为模板，扩增桑树查尔酮异构酶基因的保守区域； 2)基于获得的桑树查尔酮异构酶基因的保守区域设计基因特异引物，采用接头PCR获得保守区域的侧翼序列； 3)采用软件sequencher(http://genecodes. com/)将获得的侧翼序列与保守区域序列进行拼接，采用NCBI网站的blastx程序预测拼接序列中含有的基因开放阅读框(ORF)及编码的氨基酸序列； 4)以桑树叶片cDNA为模板扩增桑树查尔酮异构酶基因开放阅读框(0RF)，并连接到PMD19-T Vector (TaKaRa)，挑选阳性克隆并测序。 本专利技术同时提供桑树查尔酮异构酶基因在桑树中的应用，即采用CaMV35S启动子、35SPolyA以及桑树查尔酮异构酶基因构建过表达查尔酮异构酶基因的植物表达载体，并采用农杆菌感染桑树丛生芽的方式获得转基因植株，具体步骤如下 一、植物表达载体的构建 I)以pCMBIA2301质粒为模板，采用PCR法分别扩增得到35S启动子及35SPolyA片段，以桑树叶片cDNA为模板扩增桑树查尔酮异构酶基因片段；2)将各片段分别插入植物表达载体PCMBIA2301的相应酶切位点中，构建成35S启动子-CHI-35SPolyA的表达盒，并进行序列测定； 二、桑树查尔酮异构酶基因ifed的过表达 1)利用冻融法将植物表达载体转入农杆菌，采取PCR法鉴定阳性克隆； 2)以桑树种子为材料进行组织培养获得丛生芽，构建具有相同遗传背景的无性繁殖系; 3)采用含植物表达载体的农杆菌感染丛生芽，获得转基因植株； 4)根据标记基因的序列设计引物对转基因苗子进行PCR检测； 5)以槲皮素为标准品，采用高效液相色谱(HPLC)技术检测转基因苗与对照组类黄酮含量的变化。上述基因侧翼序列的克隆中，接头PCR为依赖于衔接头的侧翼序列分析方法。上述植物表达载体的构建中，CaMV35S启动子是花椰菜花叶病毒启动子，一种强启动子，被广泛应用于转基因植物中进行过量表达。35SPolyA为35S的终止序列。载体pCMBIA2301是目前常用的植物双元表达载体，含卡那的抗性以及Gus标记基因。 桑树查尔酮异构酶基因的应用，将该基因应用于真核及原核表达。桑树查尔酮异构酶基因ifeCT/J应用于过量表达提高桑树类黄酮的含量。桑树查尔酮异构酶基因ifeCT/J应用于抑制查尔酮异构酶基因的表达获得新的转基因株系。桑树查尔酮异构酶基因MaCHI应用于其他植物品种的转基因。附图说明图I为MaCHI保守区域PCR电泳图。M Trans2000 ； I -MaCHI保守区域片段扩增 图2为侧翼序列的扩增电泳图。M Trans2000 ；1 5/端侧翼序列扩增；2-4:3/端侧翼序列扩增 图3为全长扩增电泳图。M Trans2000 ；1 :0RF全长PCR扩增；2 :基因全长基因组扩增 图4为ifeCT/J基因结构图。黑色长方形外显子；直线内含子；白色长方形3'端非编码区 图5为转基因植株的PCR检测图。0 :阴性对照；M Trans2000 ;1_7 :为转基因植株 图6为转基因植株黄酮类物质含量(％)。CK :对照植株；1_7 :转基因植株 本专利技术的优点是 本专利技术为类黄酮合成代谢路径中第一个关键酶基因，将桑树查尔酮异构酶基因(ifed)采用基因工程的方法，导入桑树中，实现过表达，可提高桑树各组织中类黄酮的含量(详见实施例)。此外，该专利技术还可以应用到其他植物中，改变植物体内类黄酮的含量及种类，降低从植物中提取类黄酮的成本，有利于促进类黄酮物质在医药产业中的开发利用。具体实施例方式实施例I :桑树查尔酮异构酶基因(MCHI、全长的克隆 I)以桑树中山5801 (华东蚕业研究所，顾青虹，1958)为材料(也可以其它公知公用的桑树品种为材料)，分别提取嫩叶基因组和总RNA，并将提取的总RNA进行反转录合成cDNA ； 2)根据蔷薇科植物的草莓或苹果的查尔酮异构酶基因序列，设计兼并引物Pl-F(5' >ACTATAGGGCACGCGTGGT〈3')和P1_R(5' >GAYTCVGACTCCARDACYGC〈3')，以中山5801基因组DNA为模板，扩增得到长1729bp的基因片段(图I)，连接到T克隆载体PMD19-Tsimple vector上,转化进入大肠杆菌,挑取阳性克隆并测序； 3)根据步骤2)获得的基因片段核苷酸序列，分别设计两条5'端特异引物upGSPl(5' >CATGCAGAGTCAATAGGACT〈3' )、upGSP2(5' >CTCTAAAGAACTCGACGGACTCC〈3')以及3'端特异引物 downGSPl (5' >GCTTTTCCAAAGATGAATCCATA<3' )、downGSP2 (5' >GATGAATCCATACCAGAAAAAGAG<3')； 4)合成衔接头Adaptor I (5，>P03-ACCAGCCC_NH2〈3，)和 Adaptor 2 (5，> GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT〈3’)，根据 Adaptor 2 设计两条接头特异序列 API (5' >GTAATACGACTCACTATAGGG〈3')和 AP2 (5' >ACTATAGGGCACGCGTGGT〈3')，衔接头经高温退火处理后，分别与经限制性内切酶V、炫^ III和I消化后的基因组DNA相连接，使用引物APl和up-GSPl进行5’端序列第一轮扩增，APl和down-GSPl进行3’端序列第一轮扩增；使用引物AP2和Up-GSP2进行第二轮5’端序列扩增，使用引物AP2和down-GSP2进行3’端序列第二轮扩增，获得基因侧翼片段(图2)，将片段连接到T克隆载体PMD19-T本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.桑树查尔酮异构酶基因ifed，其特征在于具有说明书序列表所示的桑树查尔酮异构酶基因核苷酸全序列、桑树查尔酮异构酶基因开放阅读框ORF序列及3'端非编码区、桑树查尔酮异构酶基因编码的氨基酸序列，以及在此序列基础上进行密码子优化或点突变所产生的与原始序列相似度在90%以上的序列。2.权利要求I所述的桑树查尔酮异构酶基因全长的克隆方法，其特征在于依次通过以下步骤实现 1)根据蔷薇科植物草莓或苹果的查尔酮异构酶基因保守序列设计兼并引物，以桑树叶片基因组为模板，扩增桑树查尔酮异构酶基因的保守区域； 2)基于获得的桑树查尔酮异构酶基因的保守区域设计基因特异引物，采用接头PCR获得保守区域的侧翼序列； 3)采用软件sequencher(http://genec...
【专利技术属性】
技术研发人员：余茂德，李军，刘长英，赵爱春，王茜龄，张琼予，金筱耘，吕蕊花，吴存容，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：
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